«Биохимия старения»

Биохимия старения (fb2) - Биохимия старения (пер. В. И. Найдич,Л. К. Обухова) 4683K скачать: (fb2) - (epub) - (mobi) - М. С. Канунго

Канунго М.С «Биохимия старения»

Предисловие редактора перевода

Сегодня уже не ощущается недостатка в монографиях, посвященных общим вопросам проблемы старения живых организмов, в том числе человека. Отчетливо сформулированы точки зрения о роли генетики и повреждающего действия внешних факторов, активно дискутируются некоторые предложения, касающиеся возможного увеличения видовой продолжительности жизни. Не меньше, чем в других современных областях медико-биологических исследований, в науке о старении используются методы и представления таких фундаментальных наук, как математика, физика, химия. Недавно в русском переводе вышла интересная обзорная книга М. Лэмб "Биология старения" (М.: Мир, 1980). По-видимому, в биохимии старения настало время строгих обобщений.

Именно эту роль и выполняет монография известного геронтолога, профессора университета в Варанаси (Индия) М. Канунго. Книга основана на курсе лекций, которые Канунго читал для студентов Университета штата Западная Виргиния (США). Из необъятной литературы по биохимии и молекулярным механизмам старения автор выбрал и обобщил все наиболее существенное для развития этой области.

В первой, вводной главе автор определяет основные понятия, используемые в биологии старения: продолжительность жизни, старение, смерть клеток, функциональные изменения, сопровождающие старение, и т. д. Он подчеркивает связь процесса старения с периодом развития организма и репродуктивным периодом и обсуждает место геронтологии среди других — биологических, медицинских и социальных — наук.

Далее автор рассматривает на молекулярном уровне структуру и функции важнейших биомакромолекул и компонентов клетки и их изменения в процессе старения.

Следуя этому плану, автор посвящает вторую главу книги хроматину. Известно, что вся генетическая информация организма сосредоточена в ДНК, комплексы которой с гистонами и негистоновыми белками представляют собой генетический аппарат клетки, получивший название хроматина. Канунго обстоятельно излагает новейшие представления о молекулярном строении отдельных компонентов хроматина, о его структурной организации и о связи его функций со структурой. С возрастом структура хроматина изменяется, в частности увеличивается его температура плавления, что свидетельствует об усилении связей белков с ДНК. Изменения хроматина могут вызывать нарушение различных функций организма и приводить к старению.

В главе, посвященной изменениям ферментов в процессе старения, автор отмечает, что обнаружить какой-либо определенный класс ферментов, возрастные изменения которого были бы специфичными, не удается. Активность некоторых ферментов не изменяется при старении, в большинстве же случаев наблюдается либо уменьшение, либо увеличение ферментативной активности. На основании приведенных данных Канунго заключает, что возрастные изменения ферментов носят регуляторный характер.

В последующих главах автор довольно подробно рассматривает возрастные изменения важнейшего структурного белка — коллагена, роль гормонов в процессе старения и другие связанные с этим процессом вопросы. В частности, он останавливается на изменении иммунного статуса организма при старении, явлениях клеточного старения и кратко излагает обсуждаемые в литературе теории старения.

В заключение автор предлагает собственную генно-регуляторную теорию старения. Согласно этой теории нет уникальных генов, вызывающих старение, т. е. старение нельзя считать запрограммированным событием. По мнению Канунго, старение является следствием полового созревания организма и результатом дестабилизации гомеостатического контроля в период репродукции. Автор оптимистически смотрит на возможность замедления старения; он обращает внимание на то, что постепенное увеличение продолжительности жизни происходило у млекопитающих в процессе эволюции.

Можно считать, что Канунго выполнил ту задачу, которую поставил перед собой при написании монографии и которую изложил в предисловии, — дать основные сведения по биохимии старения, критически рассмотреть имеющиеся в литературе данные и поставить вопросы, требующие дальнейшего изучения и разрешения.

Нет сомнения в том, что монография, которая содержит всю основную современную информацию по биохимии старения, найдет многочисленных читателей среди геронтологов, биологов, врачей — всех занимающихся биологией старения.

Н. М. Эмануэль

Предисловие

В последние два десятилетия наука о старении стремительно развивается, привлекая к себе внимание все возрастающего числа исследователей разных специальностей. Это происходит главным образом вследствие большого интереса к старению — этой чрезвычайно важной и трудной биологической проблеме, а также из-за озабоченности правительств некоторых стран прогрессирующим "старением" населения. Биология старения как самостоятельная дисциплина преподается в некоторых западных университетах студентам-старшекурсникам и аспирантам. Огромный фактический материал, особенно касающийся возрастных биологических изменений, накопленный в течение последних двадцати лет, публикуется в настоящее время в коллективных монографиях, отдельные главы которых написаны специалистами. Однако для новичков в области биологии старения или для тех, кто не обладает основательными знаниями в некоторых разделах биохимии старения, изложенный в них материал, по-видимому, далеко не прост.

Поскольку я занимался биохимическими и молекулярными аспектами старения более 15 лет, мне кажется, что для начинающих исследователей и студентов, изучающих курс биологии старения, было бы полезно аналитически рассмотреть различные стороны биохимии старения, с тем чтобы выявить недостатки прежних работ и допущенные в них ошибки, а также правильно поставить вопросы, требующие дальнейшего изучения. Изложение прежде всего основных сведений по каждому вопросу, а затем данных о возрастных изменениях может быть полезно не только для тех, кто лишь приступает к изучению старения, но и для специалистов из других областей, которым необходима некоторая подготовка по биохимии старения. Эта книга была задумана не как сборник фактов или перечень полученных результатов, скорее она предназначена служить справочником для геронтологов и руководством по курсу биохимии старения. Можно надеяться, что она будет способствовать развитию исследований по биологии старения. Будучи первой попыткой такого рода в данной области, книга, вероятно, не лишена ошибок и упущений, поэтому я буду благодарен читателям за все предложения, которые позволят ее улучшить.

Я вполне осознаю, какую ответственность берет на себя единственный автор при написании книги по такому многогранному предмету, как старение. Несмотря на все попытки быть объективным, вероятно, мне не удалось остаться беспристрастным не только при рассмотрении различных сторон проблемы, но и при обсуждении некоторых результатов. Я готов внести исправления, если на то будут достаточные основания. Если книга послужит каким-то стимулом для молодых ученых, посвятивших себя биологии старения, и вызовет интерес к некоторым поставленным в ней вопросам, это меня полностью удовлетворит. В этом случае я смогу сказать, что сделан еще один шаг к цели, приближающий нас к пониманию природы старения.

Еще один недостаток, присущий любой книге, написанной одним автором и посвященной многим аспектам проблемы, заключается в том, что не все вопросы получают в ней должное освещение, так как особое внимание уделяется лишь некоторым из них. У многих вызывает удивление то, что в книге совершенно не рассматривается вопрос старения растений. Однако мне казалось неразумным обсуждать незнакомый предмет, поскольку у меня нет никаких работ в этой области и я не следил за соответствующей литературой. Процессы старения у растений и животных имеют много общего, поэтому основная причина старения, когда она станет известной, может оказаться одной и той же как для растений, так и для животных. Несмотря на указанный пробел, не исключено, что книга окажется полезной для студентов, изучающих старение растений.

Глава, посвященная хроматину, намеренно сделана обширной, так как за последние пять лет количество информации о составе, структуре и функциях генома эукариот необычайно увеличилось и исследователи, занимающиеся старением, могут быть с ней незнакомы. Поскольку первичная причина старения имеет генетическую основу, для того чтобы вникнуть в существо проблемы, необходимо глубокое знание генома эукариот.

Так как я не могу похвастаться полным пониманием всех вопросов, затрагиваемых в книге, я попросил нескольких специалистов просмотреть и прокомментировать главы, относящиеся к их областям знания. Я особенно благодарен д-рам Р. К. Эделмену (R. С. Adelman), П. Борнстейну (P. Bornstein), С. Элджину (S. C. R. Elgin), Л. Хейфлику (L. Hayflick), P. Холлидею (R. Holliday), Т. Макинодану (Т. Makinodan), Дж. Роту (G. C. Roth) и Т. Спелсбергу (Т. Spelsberg) за то, что они не пожалели времени на эту работу. Ответственность за ошибки, которые, возможно, все-таки остались в книге, естественно, полностью лежит на мне.

Я начал писать эту книгу в 1976–1977 г. в университете Банарас Хинду благодаря тому, что Университетская комиссия по распределению фондов (Индия) предоставила мне национальную стипендию. Вслед за тем в 1978 г. я получил приглашение Университета штата Западная Виргиния, США, занять пост профессора биологии и биохимии. Я особенно благодарен за это своевременное приглашение проф. Мартину У. Шейну (Martin W. Schein) и проф. Рэю Коппелмену (Ray Koppelman). В Университете штата Западная Виргиния я имел возможность в течение двух семестров читать лекции по биохимии старения для студентов старших курсов. По своему содержанию прочитанный мною курс лекций и данная книга во многом совпадают. Представленные в ней данные могут быть изложены в 20–30 лекциях в зависимости от подготовки слушателей. Общение со студентами и прекрасная библиотека Медицинского центра университета чрезвычайно помогли мне при завершении работы над книгой в 1978 г. Я хочу, в частности, поблагодарить проф. Р. Коппелмена (R. Koppelman), заведующего факультетом биологии проф. М. У. Шейна (М. W. Schein) и заведующего факультетом биохимии проф. Э. Г. Сандера (Е. G. Sander) за их помощь и дружеское участие. Выражаю также глубокую благодарность моему учителю проф. К. Л. Проссеру (С. L. Prosser) из Университета штата Иллинойс, США, за его поддержку.

Работавшие со мной в течение последних 15 лет аспиранты помогли мне создать творческую группу, полностью посвятившую себя проблеме старения и развития. Экспериментальные данные, которые приводятся в этой книге со ссылкой на нашу лабораторию, являются результатом их самоотверженной работы. Среди тех, кого я хочу, в частности, поблагодарить: С. Н. Сингх (S. N. Singh), С. К. Патнайк (S. K. Patnaik), М. К. Тхакур (M. K. Thakur), Т. К. Джеймс (T. C. James), Дж. Б. Н. Чейни (G. B. N. Chainy), Б. К. Ратха (B. K. Ratha), Б. С. Ганди (B. S. Gandhi), С. С. Рао (S. S. Rao), В. К. Маудтил (V. K. Moudgil), О. Коул (O. Koul), Дж. Кор (G. Kaur), С. К. Сривастава (S. K. Srivastava), С. С. Полоуз (C. S. Paulose), Р. Дас (R. Das), В. Б. Сингх (V. B. Singh), П. К. Супакар (P. C. Supakar), М. М. Чатурведи (M. M. Chaturvedi) и Р. С. Пенди (R. S. Pandey). Я благодарю также Т. Родерик (T. Roderick), Р. Наговски (R. Nagowski) и Р. С. Мисру (R. S. Misra), которые печатали разные главы книги, С. Кумар (S. Kumar) — за техническую помощь и А. Н. Сингха (A. N. Singh), с интересом и энтузиазмом готовившего рисунки для книги.

Я благодарен фонду Нуфилда, Англия, PL-48 °CША, и Департаменту науки и технологии, Индия, за финансовую поддержку моих исследований в области старения и за помощь в создании научно-исследовательской группы, а также издательству "Академик пресс". Благодарю всех авторов и издателей, разрешивших мне воспроизвести рисунки из их работ.

М. С. Канунго

Глава 1. Введение

Продолжительность жизни

Период развития

Жизнь многоклеточных организмов можно разделить на три основных периода: период развития (роста), репродуктивный период и период старения[1]. В период развития происходит увеличение числа и размеров клеток, их дифференцировка, необходимая для выполнения специализированных функций, и формирование органов. Одновременно увеличиваются размеры органов и всего организма и развиваются функции организма. Эти изменения приводят к появлению репродуктивной способности. Однако развитие продолжается и после того, как наступает половая зрелость организма. Например, человек достигает зрелости в возрасте около 12 лет, а его развитие, измеряемое по увеличению роста, продолжается до 20 лет. Некоторые организмы, например пойкилотермные позвоночные и беспозвоночные, растут еще довольно долго после того, как они вступают в период половой зрелости. Между максимальной продолжительностью жизни и возрастом, когда наступает половая зрелость организма, существует хорошая корреляция, по крайней мере у млекопитающих (табл. 1.1). Исключения, наблюдающиеся в нескольких случаях, можно объяснить адаптивными свойствами которые возникли в особых местах обитания. Было бы интересно установить, существует ли такого рода корреляция и у других животных?

Таблица 1.1. Продолжительность жизни и длительность периода достижения половой зрелости для различных млекопитающих [7]

Репродуктивный период

Этот период уникален в том смысле, что в это время организм способен к воспроизведению себе подобных. Свойства организмов, которые отбираются в ходе естественного отбора для того, чтобы индивидуумы данного вида смогли достичь половой зрелости, способствуют сохранению, выживанию и эволюции видов. Организмы, не достигающие половой зрелости, не имеют значения для сохранения и эволюции вида. Репродуктивный период характеризуется уникальными структурными и функциональными перестройками в организме и появлением веществ, необходимых для воспроизведения, таких, как некоторые гормоны у позвоночных. Этот период характеризуется также тем, что в его начале скорость воспроизведения велика, а затем постепенно уменьшается. Обычно считают, что чем больше производится потомства или чем выше скорость воспроизведения или короче время генерации вида, тем меньше максимальная продолжительность жизни. Например, мыши и крысы размножаются гораздо быстрее, чем более крупные млекопитающие, такие, как человек или слон, и продолжительность жизни первых меньше, чем продолжительность жизни последних (табл. 1.1). По-видимому, во время воспроизведения в организме возникает недостаток некоторых важных веществ, запасы которых не пополняются так же быстро, как они уменьшаются. Было бы интересно выяснить, влияет ли потеря этих веществ на продолжительность жизни. Длительность репродуктивного периода более или менее известна, особенно для особей женского пола. Люди обоего пола достигают половой зрелости в возрасте около 12 лет. У женщин способность к воспроизведению заканчивается около 45 лет с наступлением менопаузы. Крысы становятся половозрелыми в возрасте 10 нед, и их самки перестают давать потомство при достижении возраста около 70 нед.

Период старения

Старение свойственно всем многоклеточным организмам. Оно характеризуется нарушениями функциональных способностей организма. Это становится заметным в конце периода воспроизведения, который постепенно переходит в период старения. Последний имеет важную отличительную черту — в этом периоде невозможно воспроизведение. Кроме того, уменьшается активность всех органов. Ряд изменений, происходящих на молекулярном и клеточном уровнях, приводит к нарушению функционирования органов и организма в целом. Длительность периода старения нельзя определить точно, так как неизвестно, в какой момент времени начинаются нарушения функций. Если принять за критерий старения исчезновение способности к воспроизведению, то можно считать, что у женщин оно начинается в возрасте около 45 лет. Однако известно, что некоторые функции, например мышечная активность и дыхание, начинают нарушаться и у мужчин, и у женщин уже в возрасте около 30 лет. Период старения не имеет большого значения для сохранения и эволюции видов.

Итак, периоды развития, воспроизведения и старения следуют один за другим. Время наступления, длительность и скорость старения зависят от репродуктивного периода, а свойства последнего определяются периодом развития. Все три периода взаимосвязаны. Следовательно, старение нельзя рассматривать как изолированный и независимый период жизни. Для понимания процессов старения очень важна информация, касающаяся периодов развития и воспроизведения.

Функциональные возрастные изменения

Длительные исследования изменений различных функций у одних и тех же добровольцев показали, что с возрастом различные функции нарушаются с разной скоростью (рис. 1.1). Эти исследования были начаты, когда добровольцам-мужчинам было 30 лет, причем неизвестно, имелись ли уже нарушения функций, изменения которых были обнаружены в 30 лет, в более раннем возрасте. Поскольку измеряли физиологические функции, их изменения, очевидно, отражают большие сдвиги в активности клеток и органов. Возможно, что молекулярные изменения, которые приводят к этим физиологическим изменениям, и изменения в общем функционировании всего организма человека происходят еще раньше, но это нельзя с определенностью утверждать, если не применяются высокочувствительные методы исследования.

Рис. 1.1. Возрастные нарушения некоторых физиологических функций человека (в процентах от средней величины, полученной для 30 лет) [6]

Даже если с большей или меньшей точностью ограничить максимальную продолжительность жизни индивидуумов данного вида некоторым интервалом, приходится признать, что нарушения функций разных органов начинаются в разное время, а скорость происходящих изменений различна для разных органов. Пока еще неизвестно ни одной функции или параметра, изменения которых начинались бы в одном и том же возрасте и протекали бы с одной и той же скоростью у всех индивидуумов вида при данных внешних условиях. Таким образом, до сих пор не удалось охарактеризовать процесс старения с помощью какого-либо специфического параметра. Биологи использовали в качестве показателя старения только один параметр (в основном для удобства) — хронологический возраст организма. Однако общеизвестно, что этот критерий может быть ошибочным, так как нередко можно встретить человека, который в 60 лет активен, как 40-летний, или человека, который в 40 лет не активен подобно 60-летнему. Из-за нехватки точных сведений о процессе старения широко используются довольно расплывчатые и описательные определения старения, например "постепенное уменьшение приспособляемости организма к нормальным условиям внешней среды, начинающееся после наступления половой зрелости", или: "процесс, который, после наступления половой зрелости, делает организм более восприимчивым к заболеваниям".

Изменения в различных видах активности организма (рост и другие функции), начинающиеся в эмбриональной стадии и продолжающиеся до самой смерти, напоминают движение копья, брошенного вверх под углом 45°. Сначала оно летит быстро, затем его полет постепенно замедляется, оно достигает "плато" и снижается, причем по мере приближения к земле скорость его падения увеличивается благодаря силе тяжести. Аналогичным образом быстро увеличивается рост и развиваются другие функции человеческого эмбриона; это продолжается после рождения примерно до 16 лет, затем развитие функций начинает замедляться и выходит на плато к 20 годам. До 30–35 лет никаких заметных изменений функций не обнаруживается, но с наступлением этого возраста некоторые функции начинают нарушаться, и скорость этого процесса с возрастом увеличивается. Так, в возрасте 60–70 лет скорость снижения всех функций выше, чем между 50 и 60 годами. Уменьшение общей активности ускоряется с возрастом благодаря эффектам накопления нарушений функций различных органов или клеток в ранние периоды. Следовательно, с того момента, как появляются эти нарушения, начавшийся процесс постепенно ускоряется, т. е. развивается по экспоненциальному закону. Это характерно для эффектов накопления разрушающих изменений в ранние периоды жизни. Однако остается неизвестным, в какой момент начинаются нарушения функций каждого отдельного органа. Эти нарушения для разных органов различны; они различаются по скорости и величине для индивидуумов одного и того же вида даже в совершенно одинаковых внешних условиях, не говоря уже о разных.

Именно в период старения уменьшается приспособляемость к внешним и внутренним стрессам, разрушается механизм гомеостаза и увеличивается подверженность болезням. Смерть наступает в какой-либо момент этого периода не потому, что все функции уменьшились до нулевого уровня, а потому, что одно или несколько заболеваний или стрессов в течение этого периода действуют на тот или иной орган(ы) настолько глубоко, что его (их) восстановление становится невозможным.

Гибель клеток

События, которые происходят в период развития, более или менее определены, и время их протекания зафиксировано, как, например, момент образования гаструлы, появления сомитов, рождения, наступления половой зрелости. Все процессы, протекающие в период развития, важны — все они прошли сито естественного отбора. Они способствуют формированию организмов, способных к активному воспроизведению; следовательно, эти процессы необходимы для сохранения видов. В период развития происходит также гибель некоторых клеток. Например, установлена локальная гибель клеток в зачатках конечностей куриных эмбрионов, в проксимальных концах крыльев насекомых, хвоста головастиков, пронефроса и мезонефроса у высших позвоночных. Это важно для формирования специфических органов, необходимых для правильного функционирования организма. Гибель клеток, происходящая в период развития, особенно перед наступлением половой зрелости, не означает, что организм стареет, в то время как происходит его развитие, поскольку гибель этих клеток ведет к возникновению активного, сильного и способного к воспроизведению, а не дряхлого организма. Следовательно, высказываемое иногда предположение о том, что старение начинается уже в стадии эмбриона, по-видимому, неверно, так как гибель клеток, необходимая для формирования и эффективного функционирования какого-либо органа, не может быть одновременно причиной старения этого органа или всего организма. Имеет ли гибель клеток в период старения и в период развития одну и ту же причину — неизвестно.

Гибель клеток, которая наблюдается после того, как органы полностью сформировались и стали функционировать, можно принять за признак старения данного органа, как, например, в случае гибели нейронов и клеток сердечной или скелетных мышц после наступления половой зрелости. У человека эти клетки вскоре после рождения теряют способность к делению и таким образом становятся постмитотическими. Они начинают гибнуть после того, как заканчивается период развития, и новыми не заменяются. Следовательно, их гибель должна ухудшать функционирование органов, так что в этом случае гибель клеток можно рассматривать как признак старения. Что же тогда считается признаком старения органов, клетки которых остаются премитотическими, т. е. продолжают делиться на протяжении всей жизни, как это наблюдается у клеток эпителия кишечника, ретикулоэндотелиальной системы, кожи и печени? По окончании периода развития скорость деления клеток в этих органах уменьшается, их обновление замедляется, а продолжительность клеточного цикла возрастает. Это и можно считать признаком старения, поскольку более медленное обновление клеток может приводить к сохранению в органе старых клеток в течение более длительного времени и к ухудшению функционирования этих органов. Гибель постмитотических клеток, таких, как нейроны и клетки мышц, и замедление клеточного цикла у премитотических клеток, таких, как клетки эпителия и ретикулоэндотелиальной системы, могут быть вызваны совершенно разными причинами, но и то и другое должно ухудшать функционирование органов и, следовательно, приводить к старению.

Связанные с возрастом изменения в организме человека

Так как одной из важнейших целей изучения процесса старения является приобретение знаний, которые могут принести пользу человеку, ниже мы кратко рассмотрим изменения, происходящие в различных органах человека по окончании репродуктивного периода.

Как правило, после 50 лет у человека возникают внешние, видимые признаки старения кожи. Появляются рубцы, пигментные пятна, бородавки и родинки. Всем известным признаком являются морщины, которые образуются из-за потери подкожного жира. Другие характерные признаки, определяемые генетическими факторами, — это выпадение и поседение волос на голове. Преждевременное выпадение или поседение волос наблюдается у тех людей, родителям которых также свойственна эта особенность. Уменьшается число клеток и потовых желез, что делает кожу более тонкой и шершавой. Происходят структурные изменения коллагена кожи, приводящие к уменьшению ее эластичности и увеличению хрупкости (гл. 4).

Наблюдаются изменения и в системе пищеварения, к ним относятся потеря зубов из-за дегенерации тканей, поддерживающих зубы, и уменьшение секреции пищеварительных соков; печень уменьшается в размерах, и часто возникает цирроз; увеличивается число дивертикулов в толстом кишечнике.

В сердечно-сосудистой системе уменьшается пропускная способность сердца, а давление крови из-за уменьшения эластичности кровеносных сосудов повышается, так как коллаген в этих органах претерпевает структурные изменения. На стенках кровеносных сосудов откладываются холестерин и соединения кальция. Возникает атеросклероз и возрастает частота появления тромбов.

Нарушаются функции почек. Главным образом уменьшаются поток крови, гломерулярная фильтрация и реабсорбция необходимых веществ через стенки канальцев. Скорость потока крови и гломерулярная фильтрация сильно зависят от гормонов. Таким образом, функциональные нарушения в почках связаны с изменениями в сердечно-сосудистой и эндокринной системах (рис. 1.1).

Скорость возникновения функциональных расстройств в дыхательной системе — одна из самых высоких. Возможно, причиной является наибольшая подверженность этой системы действию загрязнений окружающей среды. С наибольшей скоростью уменьшается жизненная емкость легких (максимальный объем воздуха, который можно набрать в легкие или выдохнуть; рис. 1.2). Уменьшается также скорость дыхания, что снижает поступление кислорода в ткани и клетки.

Рис. 1.2. Уменьшение с возрастом жизненной емкости легких у женщин (А) и у мужчин (Б) [5]

Нарушения в мышечной системе, особенно в сердечных и скелетных мышцах, проявляются в уменьшении общей активности организма. Уменьшаются время сокращения мышцы, величина и частота сокращений. Помимо других факторов, это может быть обусловлено постепенной потерей клеток, постмитотических по своей природе. Мышцы становятся расслабленными и вялыми. Погибшие клетки заменяются коллагеном.

В период развития и при достижении индивидуумом половой зрелости важную роль играет эндокринная система. За правильный рост ответственны гормон роста, тироксин, паратгормон и кальцитонин. Пептидные гормоны гипофиза и стероидные гормоны гонад участвуют в функции воспроизведения. Некоторые гормоны ответственны за общий метаболизм и гомеостатический контроль различных функций. Гормоны синтезируются в специфических эндокринных органах, но действуют на клетки-мишени или на органы, находящиеся где-либо в другом месте организма. Их действие опосредуется рецепторами. Изменения в синтезе или транспорте гормонов или в синтезе рецепторов влияют на действие гормонов. С возрастом уменьшается не только содержание некоторых гормонов, но также и ответ некоторых тканей-мишеней на действие специфических гормонов. Например, в пожилом возрасте уменьшается выход жирных кислот из жировой ткани при действии адреналина и ослабевает индукция ферментов гормонами (гл. 5), т. е. нарушается регуляторная роль некоторых гормонов.

Иммунная система также повреждается, доказательством чего служит повышенная в пожилом возрасте восприимчивость к болезням. Резистентность к заболеваниям обусловлена функционированием в иммунной системе лимфоцитов. За гуморальный иммунитет ответственны иммунокомпетентные В-лимфоциты, образующиеся в костном мозге и вырабатывающие иммуноглобулины, или антитела, специфичные по отношению к определенным экзогенным веществам, или антигенам. Т-лимфоциты, вырабатывающиеся в тимусе, ответственны за клеточный иммунитет, например за отторжение трансплантатов. В пожилом возрасте функции Т-клеток нарушаются. Кроме того, увеличивается частота аутоиммунных заболеваний, когда иммунокомпетентные лимфоциты ошибочно принимают собственные клетки организма за чужие и синтезируют против них антитела, как это происходит при тиреоидите Хашимото, артрите и аддисоновой болезни (гл. 7).

Меняются как структура, так и функции центральной нервной системы. В мозгу имеются клетки двух типов — нервные и глиальные. У взрослого человека 1010 нейронов и 1011 глиальных клеток. Нейроны перестают делиться с момента рождения. Таким образом, у 80-летнего человека нейроны так же стары, как и сам человек. Глиальные клетки представлены несколькими типами, и их функции изучены еще довольно слабо. Они продолжают делиться в течение всей жизни, правда, скорость их деления по прошествии репродуктивного периода замедляется. Нейроны группируются в ядра, которые контролируют специфические функции. По окончании периода зрелости в отдельных участках мозга нейроны гибнут. Поскольку в каждое ядро входят сотни нейронов, что значительно превышает их минимальное необходимое число, при этом не наблюдается никакого видимого повреждения функций мозга вплоть до последних стадий зрелого возраста. Повреждение некоторых функций центральной нервной системы связано с уменьшением скорости прохождения импульса по нервным волокнам (максимальная скорость импульса равна 100 мс-1). К таким функциям относится, например, память, которая требует интеграции нескольких функций, а также координации функций, или контроль нервной системой вегетативных функций, для которого необходимо выделение нейромедиаторов в нервных окончаниях. С возрастом уровень нейромедиаторов падает и их выделение в отдельных областях мозга уменьшается. Уменьшается также содержание ферментов, ответственных за их синтез.

С возрастом нарушаются практически все сенсорные функции. Уменьшается способность глаз к аккомодации, так как ухудшается функционирование мышц, меняющих структуру хрусталика, и изменяется структура коллагена хрусталика. В результате глаз не может эффективно сфокусироваться на близлежащих предметах, и расстояние до ближайшей точки ясного видения линейно возрастает. Это ведет к пресбиопии, или старческой дальнозоркости. Этот фактор контролируется генетически, так как известно, что у тех, кто преждевременно становится дальнозорким, родители также имели этот дефект. В старческом возрасте хрусталик часто мутнеет, что ведет к развитию катаракты. Острота зрения, являющаяся показателем разрешающей способности глаза, т. е. способности различать детали в контрастном изображении, также уменьшается. Увеличивается время, которое требуется глазу, чтобы увидеть предмет в темноте после экспозиции на ярком свету, что свидетельствует о снижении адаптации к темноте.

Падает чувствительность уха к звуковым волнам высокой частоты, которые воспринимаются сенсорными клетками в проксимальной части улитки. Происходит ли это из-за гибели сенсорных клеток или из-за нарушения их функции — неизвестно. В старческом возрасте уменьшается чувствительность к запаху и вкусу, так как гибнут обонятельные и вкусовые рецепторы. Нарушается также чувство равновесия, за которое ответственны полукружные каналы.

Это краткое перечисление показывает, что по окончании периода зрелости нарушаются функции практически всех органов. Графики происходящих изменений показаны на рис. 1.1. Возрастное нарушение функций не является особенностью человека, оно характерно для всех организмов. Изменения велики, и их причиной должны быть изменения на клеточном и молекулярном уровнях. Выяснение молекулярных основ этих изменений может помочь в понимании причин старения, в разработке методов замедления изменений и тем самым самого старения.

Значение проблемы старения

В начале нашего столетия основной причиной смерти людей считали инфекционные заболевания. Это были болезни дыхательных путей, туберкулез и желудочные инфекции (заболевания перечислены в порядке значимости). Таким инфекционным заболеваниям человек был подвержен в любом возрасте. С открытием антибиотиков и появлением других достижений медицинской науки эти болезни стали более или менее контролируемыми, особенно в развитых странах. Это привело к значительному увеличению средней продолжительности жизни человека — от 40 до 70 лет (рис. 1.3). Однако контроль за инфекционными болезнями не создает у человека иммунитета к старению и смерти. В последние два десятилетия основными причинами смерти людей являются заболевания сердечно-сосудистой системы, рак и сосудистые заболевания мозга (рис. 1.4). Эти болезни, по-видимому, имеют внутренние причины и называются "болезнями старческого возраста". В настоящее время инфекционные болезни практически не влияют на среднюю продолжительность жизни людей в развитых странах, где имеется доступное для всех медицинское обслуживание. Подсчитано, что если полностью ликвидировать все инфекционные заболевания, то средняя продолжительность жизни человека может увеличиться на 0,2 года. Однако если исчезнут сердечно-сосудистые заболевания, то средняя продолжительность жизни возрастет примерна на 10 лет.

Рис. 1.3. Ожидаемая продолжительность жизни в разных странах — число доживающих (ось ординат) до определенного возраста (ось абсцисс) на 100000 мужчин [1, 3]:

1 — Индия (1921–1930); 2 — Мексика (1930); 3 — Япония (1926–1930); 4 — США (1900–1902); 5 — Италия (1930–1932); 6 — США (1929–1931); 7 — США (1939–1941); 8 — Новая Зеландия (1934–1938); 9 — США (1949–1951); 10 — США (1969)

Рис. 1.4. Основные причины смерти людей в США в 1967 г. по сравнению с 1900 г. [2]

Быстрое и успешное развитие биологических и медицинских наук позволяет надеяться, что человек достигнет своей максимальной продолжительности жизни — около 100 лет. В развитых странах около 15 % населения имеют возраст более 60 лет. К 2000 году доля таких людей возрастет до 20 %; это означает, что каждый пятый человек будет старше 60 лет. Женщины составляют около 65 % той части населения, возраст которой превышает 60 лет. В развивающихся странах из-за недостатков в системе охраны здоровья, отсутствия контроля за инфекционными заболеваниями, неправильного питания и недоедания средняя продолжительность жизни остается на уровне 50 лет и только около 5 % населения имеют возраст более 60 лет. С улучшением медицинского и других видов обслуживания этот процент увеличится. На рис. 1.5 показана возрастная структура населения в Швеции и Индии. В Швеции людей в возрасте 60–64 лет столько же, сколько в возрасте 30–34 лет. В Индии же, как и в других развивающихся странах, число людей 60–64 лет гораздо меньше, чем 30-34-летних. Ожидается, что в результате успехов медицинского обслуживания и контроля за рождаемостью в развивающихся странах в недалеком будущем скорость роста населения уменьшится до нуля и возрастная структура населения станет близкой к структуре в Швеции и других развитых странах.

Рис. 1.5. Возрастная структура населения в Индии (А) и Швеции (Б) [4]

Одним из результатов прогресса биологических и медицинских наук является быстрый рост числа людей в возрасте старше 60 лет, которые более подвержены болезням, физически менее способны выполнять работу и нуждаются в уходе. Хотя за последнее столетие интерес биологов к проблемам развития, путям деления оплодотворенного яйца, дифференцировке и формированию органов и в конце концов к тому, как организм достигает половой зрелости, был велик, до 50-х годов старение и следующая за ним смерть рассматривались как неизбежный процесс и не привлекали серьезного внимания ученых. Кроме того, старых организмов любого вида мало, и это также ограничивало масштабы исследований в этой области. Однако в последние два десятилетия быстрый рост числа старых людей и связанные с ним проблемы стимулировали и сделали необходимыми исследования процесса старения, которые привлекли внимание правительств разных стран к серьезности этих проблем.

Учение о старении

Наука, изучающая различные проблемы старения, называется геронтологией (geron — старый человек). Она имеет три аспекта.

Биологический

В этом разделе геронтологии рассматриваются фундаментальные аспекты старения. Исследователи, работающие в этой области, изучают молекулярные, биохимические, биофизические, физиологические и структурные изменения, происходящие в организме после достижения половой зрелости, и ставят цель — найти причины старения. Это может в конечном счете помочь разработать средства, с помощью которых можно было бы если не предотвратить старение вообще, то отодвинуть, отсрочить момент наступления старческого возраста.

Клинический

Это направление включает изучение болезней "старческого возраста", таких, как сердечно-сосудистые, сосудистые заболевания мозга, рак, артрит, ревматизм, аутоиммунные болезни, и разработку методов их лечения. Оно называется гериатрией, и в него вовлечены главным образом исследователи, имеющие медицинское образование.

Социально-психологический

Это направление имеет дело с социальными и психологическими проблемами старых и удалившихся от дел людей. Работающие в этой области заботятся о благополучии людей, о том, как обеспечить физическую и умственную занятость и сделать счастливыми стариков в оставшийся период их жизни.

Исследования биологических аспектов старения, целью которых является отыскание причин старения, — это чрезвычайно сложная проблема. В них необходимо использование данных разных дисциплин — биологии, физиологии, биохимии, биофизики, молекулярной биологии, химии и физики, т. е. это идеальная область для сотрудничества и междисциплинарных работ. Эти работы имеют чрезвычайно важное теоретическое и прикладное значение. При изучении проблем старения могут быть решены три важные задачи.

1. Старение — явление универсальное, и выяснение его причин было бы фундаментальным открытием. Эта проблема чрезвычайно сложна, так же как проблема развития — еще одного универсального явления. По ряду важных вопросов биологи приходят к различным выводам. Почему у всех организмов после достижения половой зрелости происходит нарушение функций? Почему все члены одного и того же вида имеют более или менее фиксированную продолжительность жизни? Почему крысы живут три года, слон — 70 лет, а человек — 100 лет? В каком возрасте после наступления половой зрелости начинается процесс старения? Существует ли триггер, "запускающий" процесс старения? Если да, то каким образом это происходит? Запрограммирован ли этот процесс, как запрограммировано развитие? Вот те вопросы, которые привели любознательных биологов к конфронтации и на которые необходимо ответить.

2. Ответы на поставленные выше вопросы могут помочь созданию научных методов, с помощью которых удалось бы отсрочить или предотвратить начало процесса старения, т. е. проконтролировать процесс старения. Это способствовало бы увеличению периода активной и энергичной жизни с 20–40 лет до, скажем, 20–60 лет или более, а также значительному удлинению периода плодотворной деятельности людей, причем немаловажную роль играет то, что при этом они получали бы моральное удовлетворение. Нужно не просто увеличить число проживаемых лет, а обеспечить людям лучшее здоровье. Другими словами, необходимо "добавить больше жизни к годам, а не больше лет к жизни" ("add life into years and not years into life"), как звучит девиз Американской ассоциации геронтологов. Существует древнегреческая легенда, в которой рассказывается" как Титон попросил и получил бессмертие. Однако он забыл попросить избавить его от старости и поэтому не умирал, но со временем все больше и больше дряхлел.

Продление активного периода жизни автоматически означало бы увеличение средней продолжительности жизни. При этом каждый индивидуум мог бы иметь надежду прожить максимальный срок — около 100 лет, с более коротким периодом старения. Смерть организма наступит в какой-то момент даже в том случае, если все болезни старческого возраста будут взяты под контроль, так как живая система, как и любая другая, подчиняется законам природы. С течением времени она стремится к более вероятному и равновесному состоянию с большей энтропией, и в результате этого происходит постепенное разрушение и смерть. Можно надеяться, что после того, как будут найдены причины старения, период старости, который сейчас занимает примерно 10 лет после 60, станет короче, даже если средняя продолжительность жизни благодаря контролю за процессом старения подойдет к 100 годам.

3. Ожидают также, что с увеличением периода активной жизни отодвинется срок появления старческих болезней, таких, как сердечно-сосудистые заболевания и сосудистые заболевания мозга, рак, артрит и т. д., которыми заболевают обычно в возрасте 40–50 лет, когда человек находится в расцвете своей деятельности. Такой сдвиг имел бы огромное значение, так как общество использовало бы опыт этих людей в течение более длительного периода времени. На решение проблем, связанных с перечисленными заболеваниями, тратится сейчас много средств и времени. Например, Национальный институт здоровья в США в 1973 г. израсходовал на исследования в области рака около 2 долл. на человека, а на геронтологические исследования — только 2 цента. Если же будут найдены способы продлить период зрелости, время наступления болезней будет отодвинуто и, таким образом, будут сэкономлены большие средства.

За последние два десятилетия число ученых, занимающихся исследованиями в области старения, сильно возросло. Для объяснения процесса старения было предложено несколько теорий и моделей, которые можно разделить на две категории.

Первая категория — это теории, которые объясняют старение, основываясь на изменениях, происходящих на уровне генома. Эти теории, следовательно, предполагают, что старение происходит из-за изменений в первичных центрах организма, т. е. в генах.

Ко второй категории относятся теории, согласно которым старение происходит из-за изменений во вторичных продуктах, детерминируемых генами, — в ферментах, коллагене, гормонах — и из-за разрушения различных клеточных структур, например мембран, лизосом, митохондрий, или из-за таких изменений, как изменение гомеостаза и механизмов защиты. Очевидно, что эти изменения по своей природе вторичны, так как любое изменение в структуре или регуляции должно иметь первоначальную причину в изменении функции генома, ответственного за синтез различных компонентов.

Были проведены исследования на уровне организмов разной сложности, включая человека, других млекопитающих, насекомых, нематод и простейших. Для ответа на специальные вопросы использовали срезы тканей и культуры клеток. Каждая модель способствует пониманию проблемы старения и в то же время имеет свои недостатки. Например, если в организм вводят какие-либо вещества, а затем для изучения берут отдельные органы, то обычно неизвестно, одинаково ли проникают эти вещества в соответствующие органы в разном возрасте. Использование срезов тканей и культуры клеток имеет свои недостатки: когда изучают действие химических веществ на ткани, взятые в разном возрасте, нельзя учесть оказываемое in vivo влияние на эти клетки других органов и циркулирующих в организме жидкостей.

Литература

1. Comfort A. Ageing: The Biology of Senescence, Holt, Rinehart and Winston, San Francisco (1964).

2. Donabedian A., Axelford S. J., Swearingen C., Jameson J. In: Medical Care Chart Book (5th edn.), Ann. Arbor., Michigan: Bureau of Public Health Economics, University of Michigan, School of Public Health (1972).

3. Golenpaul D. Information Please Almanac, Atlas and Yearbook, Dan Golenpaul Associates, New York (1973).

4. Leaf A. Sci. Amer., 229, 45–52 (1973).

5. Muiesan G., Sorbini C. A., Grassi V. Bull. Physio-Pathol. Respir., 7, 973-1007 (1971).

6. Shock N. W. In: Program and Papers of the Conference on Gerontology, pp. 123–140, Duke University (1959).

Дополнительная литература

Ниже приводится список книг и журналов, содержащих материалы о старении. Некоторые исследователи публикуют работы по старению в биохимических и физиологических журналах общего профиля.

Книги

Behnke J. A. (Ed.). The Biology of Aging, Plenum Press, New York (1978).

Birren J. E. (Ed.). Handbook of Aging and the Individual, University of Chacago Press, Chicago (1959).

Comfort A. Ageing: The Biology of Senescence, Holt, Rinehart and Winston, San Francisco (1964). [Имеется перевод: Комфорт А. Биология старения. — М.: "Мир", 1967.]

Cristofalo V. J., Roberts J., Adelman R. C. (Eds.) Explorations in Aging, Plenum Press, New York and London (1974).

Cutler R. C. (Ed.). In: Cellular Aging, Part I and II, Interdisc. Topics in Gerontology, Vols 9 and 10, S. Karger, Basel (1976).

Emerson G. M. (Ed.). Aging, Dowden, Hutchinson and Ross, Stroudsburg (1977).

Finch C. E., Hayflick L. In: Handbook of the Biology of Aging, Van Nostrand, New York (1977).

Gershon S., Terry R. (Eds.) Neurobiology of Aging, Raven Press, New York (1976).

Gutman E., Hanzlikova V. Age Changes in the Neuromuscular System, Scientechnica, Bristol (1972).

Holeckova E., Cristofalo V. J. (Eds.). Aging in Cell and Tissue Culture, Plenum Press, New York (1970).

Kohn R. R. Principles of Mammalian Ageing, Prentice-Hall, Englewood Cliffs (1971).

Lamb M. J. Biology of Ageing, John Wiley and Sons, New York (1977). [Имеется перевод: Лэмб М. Биология старения. — М.: "Мир", 1980.]

Lints F. A. In: Genetics of Ageing, Interdisc. Topics in Gerontology, Vol. 14, S. Karger, Basel (1978).

Rockstein M. (Ed.). Theoretical Aspects of Ageing, Academic Press, New York and London (1974).

Schneider E. L. (Ed.). Genetics of Aging, Plenum Press, New York (1978). Shock N. W. Biological Aspects of Aging, Columbia University Press, New York (1962).

Strehler B. L. In: Time, Cells and Aging (2nd Edn.), Academic Press, New York and London (1977).

Timiras P. S. In: Developmental Physiology and Aging, MacMillan, New York (1972).

Walford R. L. In: The Immunological Theory of Aging, Williams and Wilkins, Baltimore (1969).

Журналы

Advances in Gerontological Research, Vol. 1–4 (B. L. Strehler, Ed.), Academic Press, New York and London.

Experimental Gerontology, Pergamon Press, Oxford.

Geriatrics, Lancet Publications, New York.

Gerontology, S. Karger, Basel, Switzerland.

Journal of Gerontology, Gerontological Society of America, Washington, D. C.

Mechanisms of Ageing and Development, Elsevier-Sequoia, The Netherlands.

Глава 2. Хроматин: структура и функции

Введение

Вся биологическая информация в живых организмах заключена в генетическом материале, т. е. в ДНК. Поэтому любое повреждение структуры и нарушение функций генетического материала может привести к изменениям структуры и функций организма. В процессе развития многоклеточных организмов в генетическом материале наблюдаются функциональные изменения двух типов. Во-первых, несмотря на то что все клетки образуются из единственной зиготы, на ранних стадиях развития происходит их дифференцировка, вследствие чего определенные клетки производят специфические белки, которые не продуцируются другими клетками. Вот несколько примеров такой специфичности: гемоглобин образуется в эритроцитах, иммуноглобулины — в лимфоцитах, инсулин — в β-клетках островков Лангерганса, казеин — в молочной железе и т. п. Эти белки закодированы в специфических генах, которые присутствуют в клетках всех типов. Однако в результате дифференцировки эти гены активны только в специфических клетках и неактивны в других. В противоположность этому гены гистонов, негистоновых хромосомных белков, ферментов гликолиза и т. п. активны во всех видах клеток, благодаря чему эти белки имеются во всех клетках.

Во-вторых, хотя на ранних стадиях развития репликация ДНК, а затем деление клеток происходят во всех клетках, после некоторого периода увеличения числа клеток и развития организма на определенных стадиях дифференцировки в клетках некоторых типов синтез ДНК и деление клеток прекращаются. В качестве примера можно привести нейроны, а также клетки скелетной и сердечной мышцы позвоночных, которые перестают делиться вскоре после рождения, т. е. становятся постмитотическими. Некоторые из них по окончании периода развития стареют и умирают, но большая часть продолжает функционировать в течение всей жизни. Так, в клетках костного мозга, эпителия и т. п. синтез ДНК и деление продолжаются на протяжении всей жизни, т. е. эти клетки остаются премитотическими.

Каково же значение этих двух функциональных изменений в ДНК для организма и для процесса старения? Все многоклеточные организмы начинают стареть после достижения половой зрелости. Являются ли причиной старения дифференцировка и (или) постмитотическая природа клеток? Будет ли предотвращено старение, если остановить одно или оба изменения ДНК? Являются ли эти функциональные изменения ДНК необратимыми? Известно, что ДНК в клетках не находится в изолированном состоянии. Она связана в комплекс с белками двух типов: гистонами и негистоновыми хромосомными белками (НГБ), которые вместе с ДНК образуют надмолекулярный комплекс, называемый хроматином и представляющий собой генетический аппарат эукариотов. Три компонента присутствуют в комплексе приблизительно в равных пропорциях. Здесь же обнаружена и РНК, однако полагают, что она является продуктом транскрипции ДНК, а не структурным компонентом. Функция ДНК известна, роль же белков в функционировании хроматина определена недостаточно. Изменяются ли они в течение жизни? Для того чтобы выяснить, вносят ли вклад в процесс старения изменения в одном или нескольких компонентах хроматина, необходимо установить его химический состав и структуру. Структура и функции хроматина описаны в нескольких обзорах [12, 57, 74, 112, 116, 199,354].

Гистоны

Гистоны — белки с малой молекулярной массой — обнаружены в хроматине всех эукариотов. Их впервые открыли в 1943 г. Стедман и Стедман [330]. Эти белки имеют основной характер и положительно заряжены при физиологических значениях рН, поскольку они богаты лизиновыми и аргининовыми остатками. Они не содержат триптофана и присутствуют в клетках в отношении 1:1 с ДНК. Имеется пять основных типов гистонов: Н1, H2A, H2B, Н3 и Н4, которые различаются по величине соотношения лизина и аргинина. Их легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 2.1). Некоторые характеристики гистонов из тимуса теленка приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1. Параметры гистонов из тимуса теленка

Рис. 2.1. Электрофореграмма гистонов в полиакриламидном геле

Важное свойство всех гистонов состоит в том, что их положительно заряженные лизиновые и аргининовые остатки образуют кластеры в особых областях полипептидной цепи. Этим и объясняется наличие во вторичной структуре гистонов вытянутых β-структур. Очевидно, эти положительно заряженные β-структуры связываются с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК сильнее, чем с другими группами. Нейтрализация положительных зарядов в гистонах должна приводить к их отделению от ДНК. Из табл. 2.1 видно, что гистоны H2A, H2B, Н3 и Н4, находящиеся внутри нуклеосом, имеют больше вытянутых β-структур, чем гистон Н1, расположенный между нуклеосомами.

Прокариоты не имеют гистонов. Появление гистонов совпало с возникновением ясно выраженных ядер, хромосом и процесса дифференцировки. Гистоны подавляют синтез РНК [167] и ДНК [142] in vitro. При полном или частичном удалении гистонов из хроматина сильно увеличивается его матричная активность. Однако маловероятно, чтобы гистоны контролировали или регулировали транскрипцию генов, так как: а) имеется только пять основных видов гистонов, тогда как геном эукариотов содержит несколько тысяч генов; б) количество гистонов обычно постоянно в клетках всех типов и во всех периодах жизни; в) количество гистонов одинаково в метаболически активных и метаболически неактивных клетках. Следовательно, можно предположить, что гистоны включены в структуру и организацию хроматина и действуют как общие репрессоры его активности.

Гистон Н1

Гистон Н1 очень богат лизином — около 25 % входящих в его состав аминокислотных остатков составляет лизин. Он отделяется от ДНК гораздо легче других гистонов. Этому гистону свойствен полиморфизм, т. е. в одной ткани может быть несколько видов гистона Н1 с различными последовательностями аминокислот. В тимусе и печени крыс обнаружены пять изогистонов Н1. Относительное содержание изогистонов Н1 в разных тканях одного и того же организма различно [58, 114, 189, 190] и изменяется в течение клеточного цикла [160]. Показано, что различные подфракции гистона Н1 морского ежа синтезируются на разных стадиях развития яйца. В некоторых яйцах одна фракция гистона Н1 заменяется на другую во время перехода от бластулы к гаструле; в других это изменение происходит во время вылупления. Разные фракции гистона Н1 из тимуса кролика дают различные спектры кругового дихроизма с ДНК фага Т7 [370]. Отсюда следует, что различные подфракции гистона Н1 имеют различные функции [8, 307].

При изучении последовательности аминокислот подфракций гистона Н1 было показано, что в отличие от остальных четырех гистонов он имеет основной концевой COOH-участок. Концевая NH2-область (1-40) также имеет основной характер (24–39). В концевой NH2-области изогистонов Н1 найдено большое число аминокислотных замен. Эти замены, по-видимому, определяют функциональные различия изогистонов Н1 во взаимодействии с НГБ и эффекторами, а также в связывании с ДНК. Концевая NH2-область представляет собой неупорядоченную спираль. Центральный участок [(39±4)-(116±4)] кроме большого числа аминокислот кислотного характера и двух ароматических аминокислот содержит неполярные аминокислоты. Этот участок способен к образованию вторичной глобулярной структуры. Он в основном инвариантен и весьма консервативен, т. е. все гистоны Н1 различных организмов имеют в этой области практически одну и ту же последовательность аминокислот. По-видимому, она играет существенную роль в структуре хроматина.

Концевая COOH-область является сильно основной из-за наличия большого числа лизиновых остатков и весьма консервативна внутри одного вида. Поэтому она может играть общую роль во всех гистонах Н1. Она также представляет собой неупорядоченную спираль. Эта область в основном ответственна за связывание с ДНК. Предполагают, что основные области гистона Н1 связываются с ДНК, а неполярная и глобулярная центральная область взаимодействует с другими молекулами [77, 89, 154]. Стафилококковая дезоксирибонуклеаза специфически расщепляет хроматин между нуклеосомами, в результате чего образуются фрагменты ДНК, связывающие две соседние нуклеосомы. Показано, что гистон Н1 соединяется приблизительно с 30–60 парами оснований этих фрагментов ДНК, т. е., по-видимому, гистон Н1 не участвует в образовании структуры нуклеосомы, а располагается в областях между нуклеосомами. Положительный заряд гистона Н1 выше, чем у других гистонов. Он первым вытесняется из хроматина кислотой или щелочью и в большей степени подвержен разрушению протеазами, когда еще находится в связанном состоянии в комплексе хроматина [26, 263]. Если гистон Н1 добавить к хроматину с недостаточным содержанием этого гистона, то хроматин сжимается [46, 47]. Если же гистон Н1 смешать с двухцепочечной ДНК, то образуются структуры, имеющие форму бублика (тора) [166]; другие гистоны в подобных условиях участвуют в образовании глобул, похожих на нуклеосомы. Таким образом, гистон Н1, вероятно, участвует в образовании структур хроматина высшего порядка, а именно способствует закручиванию нитей нуклеосом в сверхспиральный виток с диаметром ~20 нм [47]. Аналогичные структуры образует с ДНК гистон Н5. Вероятно, различные подфракции гистона Н1 могут быть связаны с различными межнуклеосомными (линкерными) областями хроматина и участвуют в образовании разных сверхспиралей. В интерфазном хроматине ДНК свернута в несколько тысяч раз, благодаря чему она умещается по длине метафазной хромосомы. Определенную роль в этой конденсации ДНК может играть гистон Н1.

Гистон Н1 отличается от остальных гистонов быстрым обменом в культуре клеток [16]. В то время как синтез остальных четырех гистонов связан с синтезом ДНК и происходит только в S-фазе, синтез Н1 в клетках штаммов Friend и HeLa может происходить и в отсутствие синтеза ДНК, т. е. в G1-фазе [385]. В клетках ВНК синтез гистона Н1 также частично происходит в G1-фазе,[343].

Таблица 2.2. Сравнение свойств гистона Н1 и нуклеосомных гистонов

Гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4

В процессе расщепления хроматина стафилококковой дезоксирибонуклеазой образуются глобулярные структуры, называемые нуклеосомами. Анализ нуклеосом показывает, что четыре гистона — Н2А, Н2В, Н3 и Н4 — присутствуют только в них. В ходе эволюции их структуры оказались гораздо более консервативными, чем структура гистона Н1, причем структуры гистонов Н3 и Н4 более консервативны, чем структуры гистонов Н2А и Н2В. Гистон Н3 содержит цистеин в положении 110, который сохранялся в течение всей эволюции. Показано, что гистон Н3 димеризуется путем образования дисульфидного мостика [280]. Он фосфорилируется при переходе из G2-фазы в М-фазу и быстро дефосфорилируется в течение фазы G1. Таким образом, фосфорилирование предшествует образованию дисульфидного мостика.

Очищенные гистоны Н3 и Н4 образуют в растворе тетрамеры, в формировании которых принимают участие концевые COOH-участки цепи. В опытах по реконструкции с использованием частично расщепленных гистонов Н3 и Н4 показано, что первые от NH2-конца 41 и 37 остатков гистона Н3 и гистона Н4 соответственно несущественны для образования тетрамеров. Удаление 45 и 18 остатков с COOH-конца этих гистонов препятствует образованию тетрамеров. Областями, ответственными за образование тетрамеров, являются остатки 42-120 гистона Н3 и 38-102 гистона Н4 [43, 371]. Что касается гистона Н2В, то его центральная область, по-видимому, необходима для взаимодействия гистон — гистон [197].

Гистон Н5

Кроме гистонов пяти типов, которые присутствуют во всех клетках и тканях, имеющие ядро эритроциты низших позвоночных, рыб, амфибий, рептилий и птиц содержат другой гистон, Н5, который во многом похож на гистон Н1. Он был впервые обнаружен в эритроцитах цыпленка в 1961 г. [266], и позднее его существование было подтверждено [159]. Гистон Н5 содержит приблизительно 197 аминокислотных остатков, дает полосу рядом с гистоном Н1 при электрофорезе в полиакриламидном геле и имеет молекулярную массу ~23000. Ему свойствен молекулярный полиморфизм, а расположен он между нуклеосомами. Гистон Н5 связан с А-Т-областью ДНК и, так же как гистон Н1, оказывает стабилизирующее влияние на хроматин. Он тоже богат лизином, который составляет 23 % его аминокислотных остатков. С помощью метода ЯМР установлено, однако, что он отличается от гистона Н1, и, возможно, его эволюция происходила самостоятельно [78]. Лизиновые остатки гистона Н5 ацетилированы в большей степени, чем у гистона Н1, но не так сильно фосфорилированы. Он содержит большое число сериновых остатков (21), и у него, в отличие от гистона Н1, не наблюдается специфического образования кластеров из основных аминокислот на NH2-конце. В противоположность гистону Н1 его NH2-конец имеет структуру глобулы.

Информационная РНК (мРНК) гистона Н5 не содержит полиадениловой кислоты на 3′-конце, как это имеет место в случае других гистонов. У птиц на ранних стадиях развития клеток эритроидного ряда содержится мало гистона Н5. По мере развития этих клеток его количество увеличивается и, как следствие, уменьшается транскрипционная активность хроматина, хотя содержание РНК — нуклеотидилтрансферазы не меняется. В неделящихся зрелых эритроцитах синтез гистона Н5 продолжается даже тогда, когда другие пять гистонов уже не синтезируются [336]. Если гистон Н5 удалить из хроматина, то подавление транскрипционной активности ослабляется. Его синтез не координирован с синтезом других гистонов и не синхронизирован с синтезом ДНК: он синтезируется после других гистонов. Поскольку на ранних стадиях развития эритроцитов гистон Н5 отсутствует и появляется только на стадии эритробласта, когда он постепенно накапливается и подавляет при этом транскрипционную активность, было высказано предположение, что подавление происходит в результате конденсации хроматина, ведущей к его инактивации. Если ввести гистон Н5 не в эритроциты, а в другие клетки, то транскрипция также подавляется. Другое важное обстоятельство заключается в том, что вновь синтезированный гистон Н5 в развивающихся клетках эритроидного ряда фосфорилирован, а впоследствии, в ходе созревания клеток и ослабления транскрипции, дефосфорилируется. Таким образом, гистон Н5 играет, по-видимому, важную роль в поддержании сильно репрессированного состояния хроматина в имеющих ядра эритроцитах [35, 49, 168, 336]. Интересно отметить, что экспрессия гена гистона Н5 происходит только в клетках эритроидного ряда на специфической стадии, но как начинается его экспрессия и как она запрограммирована — неизвестно.

Протамины

Протамины представляют собой основные белки с малой молекулярной массой; они присутствуют в хроматине спермы вместо гистонов. Протамины появляются на стадии сперматиды и заменяют гистоны хроматина. Для них характерен полиморфизм. В сперме форели содержатся протамины трех типов, состоящие из 31–33 аминокислот. Протамины спермы млекопитающих длиннее — в их цепях ~45 аминокислот. Они богаты аргинином и не содержат лизина и триптофана; аргинин составляет две трети всех аминокислот. Собирающиеся в кластеры аргининовые остатки образуют длинные участки, с помощью которых протамины связываются с ДНК сперматид. После образования этой связи транскрипционная активность хроматина полностью подавляется. Если удалить протамины, то хроматин принимает вид бусинок и становится чувствительным к микрококковой нуклеазе. При добавлении протаминов эта структура исчезает и хроматин становится невосприимчивым к нуклеазе. Сериновые остатки протаминов могут быть фосфорилированы и дефосфорилированы. Полагают, что эта ковалентная модификация необходима для правильного связывания протаминов с ДНК [105], Ниже показана структура типичного протамина рыб:

Протамины, как и гистоны, синтезируются в цитоплазме. Их короткие мРНК транслируются на дирибосомах. Эти РНК в отличие от мРНК гистонов содержат на 3′-конце полиадениловую кислоту [169]. На 5′-конце они имеют 7-метилгуанин. Хотя в семенниках форели протамины синтезируются на стадии сперматиды, транскрипция их мРНК происходит значительно раньше, а именно на стадии первичного сперматоцита [170]. мРНК так же, как и рибонуклеопротеидные частицы, до наступления стадии сперматиды остается неактивной. Аналогичная ситуация наблюдается и в случае гистонов. Ооциты Xenopus содержат мРНК материнских гистонов в неактивной форме, которые активируются и транслируются во время деления яйца. Протамины содержатся только в сперматоцитах, однако неизвестно, почему экспрессия их генов происходит только в этих клетках и как она начинается на соответствующей стадии развития этих клеток.

Гены гистонов

Гистоны синтезируются в S-фазе клеточного цикла. Это обстоятельство помогло выделить мРНК гистонов из быстро делящихся эмбрионов для идентификации и локализации генов гистонов путем молекулярной гибридизации и клонирования [39, 51, 187, 373]. На ранней стадии дробления эмбриона морского ежа гистоны составляют 25–30 % вновь синтезируемых белков, а мРНК гистонов — почти 70 % всех мРНК. Кроме того, мРНК гистонов гибридизуются с ДНК в несколько сотен раз быстрее, чем многие другие мРНК. Это указывает на наличие большого числа копий генов гистонов. При исследовании шести видов морских ежей было показано, что гены гистонов повторяются в гаплоидном геноме 300-1000 раз. У Drosophila, Xenopus, человека и цыплят повторяемость составляет 100, 10–20, 10–20 и 10 раз соответственно. Такие большие различия в количестве этих генов могут быть связаны с тем, что гистоны необходимы на ранней стадии дробления. Яйца Xenopus содержат большое количество материнских гистонов, тогда как в яйцах морского ежа их очень мало. По-видимому, в первом случае у клеток нет необходимости синтезировать на ранней стадии быстрого деления большое число гистонов. Во втором случае нужно быстро синтезировать гистоны, чтобы не отставать от темпа быстрого деления клеток, и большое количество генов способствует этому.

В исследованиях на Drosophila показано, что гены гистонов расположены в хромосоме II. Пять структурных генов пяти гистонов богаты парами G-C и тандемно повторяются. Они разделены участками, богатыми парами А-Т, которые не транслируются. Вся область кодирования генов гистона содержит 6000–7000 пар оснований ДНК. Ниже показаны расположение и длина генов в яйце морского ежа вместе со спейсерными участками (S) [39].

Структурные гены гистонов не содержат интронов, или нетранслируемых областей, как гены глобина, яичного альбумина и иммуноглобулина, а также не транскрибируются как более длинные предшественники РНК [312]. Спейсерные области не имеют небольших повторяющихся последовательностей оснований, как это наблюдается у генов рРНК и 5S-PHK. У всех видов морских ежей порядок расположения и направления транскрипции гистоновых генов одинаковы, тогда как у разных видов Drosophila они различны [230]:

Синтез и обновление гистонов

Гены гистонов транскрибируются в направлении 5′→3′ с помощью РНК-полимеразы II, так как процесс транскрипции чувствителен к α-аманитину [225]. По-видимому, мРНК пяти гистонов транскрибируются отдельно, а не как единая полицистронная мРНК [205]. Они имеют коэффициент седиментации приблизительно 9S и могут быть разделены в полиакриламидном геле [187]. На 3′-конце мРНК гистонов нет полиадениловой кислоты [5], а на их 5′-конце присутствуют последовательности m7G(5′)pppNm или m7G(5′)pppNmpN [260].

Синтез гистонов тесно связан с синтезом ДНК. мРНК гистонов синтезируются в начале S-фазы, а затем переходят в цитоплазму, где они соединяются с рибосомами для синтеза гистонов [293, 303, 310, 331]. мРНК гистонов существуют приблизительно столько же времени, сколько длится S-период, т. е. 10–12 ч. Есть сообщение, что для транскрипции мРНК гистонов необходимы фосфорилированные НГБ [194], но оно требует подтверждения.

Если синтез ДНК затормозить с помощью цитозинарабинозида или оксимочевины, то синтез мРНК гистонов также прекращается, уже образовавшиеся мРНК разрушаются и синтез гистонов останавливается. Как только это происходит, прекращается также синтез ДНК [188, 366, 379]. Таким образом, клетка обладает механизмом, "включающим" и "выключающим" гены гистонов в соответствии с синтезом ДНК. Стехиометрическое соотношение синтезированных гистонов Н1:Н2А:Н2В:Н3:Н4 равно 0,5:1:1:1:1. Это свидетельствует о том, что четыре гена нуклеосомных гистонов транскрипционно связаны, и их трансскрипция, вероятно, скоординирована. По-видимому, матрица для гистона Н1 не связана с другими генами, поскольку количество синтезированного гистона Н1 составляет только половину количества других гистонов. У Drosophila, расположение гистоновых генов у которой отличается от расположения генов у морского ежа, ген гистона Н1 отделен от гена гистона Н3 1200 парами оснований ДНК. Следовательно, он может иметь самостоятельный промотор [230]. Более того, синтез гистона Н1 в фазе G1 в три раза интенсивнее синтеза других гистонов [343].

Известно несколько исключений из общего правила сопряжения синтеза гистонов с синтезом ДНК. Например, у лягушки Xenopus laevis при эмбриогенезе не наблюдается упомянутой синхронности на ранних стадиях дробления [3]. В зародышах Vicia faba гистоны появляются в фазах G1 и S [123]. На ранних стадиях эмбриогенеза морского ежа синтез гистонов начинается в фазе G1 и продолжается до фазы G2. Однако в начале дифференцировки их синтез становится синхронным с синтезом ДНК [17]. Обусловлена ли эта синхронизация каким-либо фактором, появляющимся на стадии дифференцировки, неизвестно. В клетках HeLa мРНК гистонов транскрибируется в течение всего клеточного цикла, но их трансляция происходит только в S-фазе [250]. Таким образом, в клетках HeLa с синтезом ДНК координирована трансляция, а не транскрипция. Очевидно, синтез гистонов регулируется на двух этапах — трансляции и транскрипции — с помощью двух разных сигналов. Поскольку молекулы мРНК гистонов малы, их трансляция происходит на дирибосомах. После синтеза гистоны переходят из цитоплазмы в ядро [366].

Судьба четырех нуклеосомных гистонов в процессе деления клетки изучалась с помощью 3Н-лизина и других меченых аминокислот [220]. На примере культуры in vitro миобластов цыпленка показано, что, когда клетка делится, уже существовавшие нуклеосомные гистоны остаются в одной из дочерних клеток, а вновь синтезированные гистоны переходят в другую клетку. Таким образом, новые гистоны, по-видимому, не смешиваются со старыми, и какое-то время их состав сохраняется неизменным. Последовательно синтезирующиеся нуклеосомы располагаются в основном рядом друг с другом. Более того, гистоны в них существуют в неизменном виде в течение трех-четырех поколений. Каким образом это достигается, неизвестно. По-видимому, существует механизм, с помощью которого дифференцированное состояние материнской клетки может передаваться дочерним. В работе с использованием 3Н-аргинина и 125I-иоддезоксиуридина в культуральной среде, содержащей клетки мыши [153], было показано, что нуклеосомные гистоны сохраняются в течение многих поколений. Этот факт очень важен, так как ново-синтезированные гистоны связаны с новообразованной ДНК [353]. Высказано предположение, что некоторые НГБ также сохраняются в процессе деления клетки [122]. Такая консервация нуклеосом и НГБ вместе с последующей транскрипционной специфичностью может служить тем механизмом, с помощью которого достигается и сохраняется дифференцировка клетки. Гистон Н1, однако, в течение одного клеточного поколения обновляется на 15 % [141]. Кроме того, он интенсивно фосфорилируется в конце фазы G2 клеточного цикла, что совпадает по времени с конденсацией хромосомы [48]. Быть может, фосфорилирование является пусковым механизмом митоза.

Структура хроматина

Химический состав хроматина был установлен несколько лет назад. Однако функции его составных частей, способ их организации, механизм конденсации хроматина во время митоза и последующего разрыхления, способ, с помощью которого происходит экспрессия определенных генов в клетках какого-либо типа и репрессия в других, механизм экспрессии генов в определенные периоды жизни и их репрессии в другое время стали проясняться лишь недавно. Для того чтобы понять механизм экспрессии генов и способы его регулирования, необходимо знать структуру и организацию хроматина.

Тщательные биохимические и биофизические исследования с использованием электронной микроскопии, начатые в 1973 г., позволили установить структуру и функции хроматина. Когда хроматин тимуса теленка гидролизовали ДНКазой, появлялись частицы размером 200 пар оснований или кратным ему [157]. Это свидетельствует о том, что хроматин имеет повторяющиеся участки. Олинс и Олинс [272] выдерживали интерфазные ядра тимуса и печени крысы и эритроциты цыпленка в гипотонической среде и изучали их под электронным микроскопом после соответствующего окрашивания. Хроматин выглядел как цепочка бусинок диаметром 7 нм, связанных друг с другом тяжами ДНК диаметром 1,5 нм (рис. 2.2). Одновременно было показано [163], что при расщеплении хроматина микрококковой или стафилококковой нуклеазами, которые разрывают обе цепи ДНК, образуются частицы диаметром 7 нм, содержащие 200 пар оснований. В работе с использованием биохимических методов и дифракции рентгеновских лучей [200] также установлено, что частицы, получаемые в процессе расщепления нуклеазой, содержат 200 пар оснований ДНК; это составляет почти 85 % общего содержания ДНК в хроматине. Каждая из этих частиц содержит по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, образующих октамер. Таким образом, эти частицы, позднее названные нуклеосомами [139], содержат восемь молекул гистонов и 200 пар оснований ДНК. Показано также [139], что при соединении гистонов четырех типов и ДНК появляются частицы, похожие на те, которые образуются из хроматина после расщепления нуклеазой. Гросс-Беллард и Шамбон ([139] высказали предположение, что центральную роль в формировании нуклеосомы играют богатые аргинином гистоны Н3 и Н4. Гистон Н1 отсутствует в этих частицах, он расположен между нуклеосомами.

Рис. 2.2. А. Электронная микрофотография хроматина из Oncopeltus fasciatus. В областях, свободных от волокон рибонуклеопротеида, виден хроматин в виде бусин; × 67000 [120]. Б. Схематическое изображение структуры хроматина

На основе описанных выше исследований было высказано предположение [198], что основная структура хроматина состоит из повторяющихся частей, содержащих октамеры гистонов четырех типов и 200 пар оснований ДНК. Во всех изученных до сих пор организмах соотношение количества ДНК и гистонов равно приблизительно 1 и везде имеются повторяющиеся участки октамеров гистонов, связанных приблизительно с 200 парами оснований ДНК, которые образуют линейную цепь нуклеосом диаметром 10 нм. Количество ДНК в нуклеосомах различных органов и организмов варьирует от 140 до 240 пар оснований [116]. Межнуклеосомная, или линкерная, ДНК более чувствительна к микрококковой нуклеазе, а нуклеосомная ДНК — к панкреатической ДНКазе I. Микрококковая нуклеаза и ДНКаза I и II расщепляют находящуюся внутри нуклеосомы нуклеосомную ДНК (или ДНК сердцевины), образуя фрагменты ДНК длиной 10 пар оснований или кратные им, но разрывают ее в разных местах [329]. Когда нуклеосомы из разных тканей и организмов расщепляют микрококковой нуклеазой, чтобы удалить линкерную ДНК, получают стабильные нуклеосомы с мол. массой 200000 и коэффициентом седиментации 11S, содержащие октамер гистонов и ДНК длиной 140 пар оснований [328]. Таким образом, размер ДНК, входящей в состав нуклеосомы, у всех организмов одинаков. Длина межнуклеосомной, или спейсерной, области, которая разделяет соседние нуклеосомы, зависит от функционального состояния хроматина. Транскрипционно активный хроматин имеет укороченную спейсерную область [225, 262].

При определении местоположения гистонов и ДНК в нуклеосомных мономерах хроматина тимуса теленка с помощью метода ЯМР было показано, что радиусы вращения ДНК и белка составляют 5 и 3 нм соответственно. Это свидетельствует о том, что ДНК расположена вне гистоновой сердцевины [21]. Внутренняя белковая сердцевина нуклеосомы имеет диаметр 6,4 нм; она окружена оболочкой из ДНК толщиной 2 нм, так что общий диаметр нуклеосомы составляет 10,4 нм. Эти данные были подтверждены иммунологическими исследованиями. Ни одна из сывороток против четырех гистонов, кроме анти-Н2В, не реагирует с нуклеосомой [2]. Это доказывает, что только гистон Н2В взаимодействует со своим антителом.

В растворе гистоны разных типов связываются попарно [94], причем наиболее сильная связь наблюдается между гистонами Н3 и Н4. Нуклеосома имеет ось симметрии второго порядка. В детальных рентгеноструктурных и электронно-микроскопических исследованиях кристаллических препаратов нуклеосом [117] показано, что сердцевина нуклеосомы представляет собой плоский клинообразный диск размером 5,7×11×11 нм. Полагают [117], что 140 пар оснований ДНК составляют 1,75 витка спирали, диаметр витка равен 9 нм, а его шаг — 2,8 нм (рис. 2.3). Это соответствует приблизительно 80 парам оснований на сверхспиральный виток В-формы ДНК. Гистоны частично погружены в большую бороздку ДНК, а малая бороздка остается открытой. Брем [50] считает, что сердцевина нуклеосомы имеет клинообразную форму, ее размеры 5,5×10×12 нм, а 140 пар оснований ДНК расположены в виде витка. Длина 140 пар оснований ДНК в 6–7 раз превышает размеры нуклеосомной сердцевины. Таким образом, ДНК конденсирована в 6–7 раз, что обусловлено ее связыванием с основными участками цепей восьми молекул гистонов и закручиванием вокруг сердцевины сверхспирали [337]. Это обеспечивает защиту нуклеосомной ДНК от микрококковой и стафилококковой ДНКаз. Однако панкреатическая ДНКаза I расщепляет эту ДНК с образованием фрагментов, состоящих из десяти нуклеотидов. Из-за спиральной структуры ДНК разные участки ее цепи отличаются друг от друга по чувствительности к ДНКазе I [238]. По-видимому, внутри нуклеосомы имеются отдельные центры, по которым происходит расщепление под действием ДНКазы. ДНКаза II расщепляет нуклеосомную ДНК с образованием двух фрагментов по 100 пар оснований [15]. С помощью гидродинамических методов показано [135], что нуклеосома претерпевает два конформационных перехода, зависящих от концентрации соли. Это служит дополнительным доказательством того, что нуклеосома включает две субчастицы, или половины.

Рис. 2.3. Предполагаемое закручивание суперспирали ДНК вокруг сердцевины нуклеосомы. Отмечены места расщепления ДНК нуклеазой [117]

Сердцевина нуклеосомы содержит по две молекулы каждого из Н2А-, Н2В-, Н3- и Н4-гистонов, которые образуют октамер. Положительно заряженные вытянутые цепи этих гистонов электростатически связаны с отрицательно заряженной ДНК. Полагают, что четыре гистона расположены относительно ДНК следующим образом:

Два гистона, Н3 и Н4, богатые аргинином, вероятно, взаимодействуют с двумя концами фрагмента ДНК. Когда эти гистоны добавляют к двухцепочечной ДНК, они образуют характерную структуру типа бублика, видимую в электронный микроскоп [129]. При воссоединении гистонов сердцевины со 140 парами оснований ДНК образуются частицы, имеющие тот же самый коэффициент седиментации, что и нуклеосомы, полученные из хроматина [36, 345]. Было также показано, что одни гистоны Н3 и Н4 образуют с ДНК структуры, похожие на сердцевины нуклеосом, устойчивые к трипсину [64, 327] и дающие картину дифракции рентгеновских лучей, похожую на картину для нативных нуклеосом [261]. Когда гистоны Н3 и Н4 добавляют к ДНК, они связываются со 140 парами оснований ДНК, которая имеет 1,5 сверхспиральных оборота вокруг тетрамера [195]. Образующаяся структура представляет собой цилиндр с размерами 45×8×8 нм. При последующем добавлении гистонов Н2А и Н2В цилиндр сжимается и становится похожим на нативную нуклеосому. Аналогичные явления наблюдал Картер [70]. Это согласуется с высказанным ранее [198] предположением, что гистоны Н3 и Н4 играют существенную роль в образовании структуры нуклеосомы. Эти два гистона наиболее консервативны, содержат большое количество β-структур и взаимодействуют друг с другом сильнее, чем с другими гистонами. По степени связывания с ДНК гистоны располагаются в следующем порядке: Н3 и Н4>Н2А>Н2В>Н1 [283]. При изучении поперечных сшивок показано, что связаны следующие пары: Н3-Н4, Н2А-Н2В и Н2В-Н4 [84].

Согласно одной из точек зрения, сначала 2 молекулы гистона Н3 и 2 молекулы гистона Н4 образуют тетрамер и связываются со 140 парами оснований ДНК, формируя основную сердцевину нуклеосомы. На втором этапе в эту структуру включаются по две молекулы гистонов Н2А и Н2В, чем и завершается образование нуклеосомы [42, 64, 258, 372]. При изучении сборки новореплицированного хроматина Drosophila показано, что гистоны Н3 и Н4 соединяются с ДНК в течение или вскоре после ее синтеза, гистоны Н2А и Н2В — на 2-10 мин позже, а гистон Н1 — через 10–20 мин, и в результате образуется зрелый хроматин [375]. По-видимому, во взаимодействие с ДНК вовлечены COOH-концы четырех гистонов, так как удаление ЫН2-концевых участков цепей гистонов не влияет на структуру нуклеосомы [371]. Гистоны Н2А и Н2В образуют димеры, взаимодействуя своими центральными неполярными областями, так что NH2- и COOH-концы остаются свободными. Гистоны Н3 и Н4 образуют димеры путем образования связей между их центральными неполярными областями и COOH-концами, так что основные NH2-концевые области нуклеосомных гистонов доступны для взаимодействия с кислотными группами ДНК [72]. Роль NH2-концевых областей четырех гистонов пока не установлена, хотя известно, что они связываются с ДНК. Мирзабеков и др. [252] путем ковалентных сшивок гистонов с 5′-концевыми фрагментами ДНК показали, что каждый гистон связан с 10 парами оснований ДНК. Сборка нуклеосом, по-видимому, контролируется НГБ. Так, очищенный препарат этих белков, выделенный из яиц Xenopus laevis, в бесклеточной системе в присутствии гистонов и очищенной ДНК катализирует образование нуклеосом [217].

Таким образом, основная структура хроматина представляет собой цепь линейно расположенных нуклеосом диаметром 10 нм, которую называют нуклеосомной фибриллой. Это низший уровень организации хроматина. Структуру более высокого порядка образуют нуклеосомы, свернутые в спираль, которая имеет диаметр 20–30 нм и шаг 10 им. Свертывание нуклеосом в спираль, по-видимому, обеспечивается богатым лизином гистоном Н1, который, как было показано, соединяется с линкерной ДНК между соседними нуклеосомами. Этот вывод следует из того, что после расщепления мононуклеосом стафилококковой нуклеазой размер ДНК уменьшается с 200 до 140 пар оснований, причем одновременно освобождается 35-парный фрагмент ДНК, связанный с гистоном Н1 [20]. Когда гистон Н1 добавляли к хроматину, который был его лишен, увеличение сродства к нему наблюдалось только до стадии образования октануклеосомы, но не далее [301]. Связывание с гистоном Н1 не только стабилизирует ДНК в линкерной области, но вызывает также ее дальнейшую конденсацию и свертывание [75]. Более высокий порядок структуры хроматина (по сравнению с цепочкой бусин) представляет собой спираль из частиц октануклеосом, образование которой обеспечивается гистоном Н1 или гистоном Н5 (в случае эритроцитов, содержащих ядра). Это согласуется с результатами, согласно которым полинуклеосомы, содержащие около шести нуклеосом, являются, по-видимому, основными матрично активными единицами хроматина, связывающимися с эндогенной РНК-полимеразой [344]. Олигонуклеосомы служат лучшими матрицами для транскрипции, чем мононуклеосомы, и на них синтезируются более длинные транскрипты [318].

Нуклеосома — динамическая единица как в структурном, так и в функциональном отношении. Как сказано выше, она состоит из двух половин, что может быть определено путем специфического связывания восьми молекул гистонов с ДНК. То, что нуклеосомы в транскрипционно активном состоянии подвержены конформационным изменениям, становится очевидным при изучении их чувствительности к ДНКазе I. Этот фермент преимущественно воздействует на те последовательности ДНК, которые активно транскрибируются. Он удаляет ДНК, кодирующую глобин, из ядер эритроцитов цыпленка, но не действует на ядра клеток мозга или фибробластов [125, 282, 367]. На ДНК яичного альбумина эритроцитов и фибробластов, в которой этот ген не транскрибируется, фермент также не действует. Стафилококковая нуклеаза, которая, как известно, расщепляет ДНК в межнуклеосомной области, не расщепляет ДНК глобина из эритроцитов цыпленка. Если мономерные нуклеосомы, полученные из этих клеток действием стафилококковой ДНКазы, обработать затем ДНКазой I, то преимущественно удаляются гены глобина. Показано [125], что ген яичного альбумина предпочтительно расщепляется ДНКазой в клетках яйцевода курицы и не расщепляется в других клетках, в которых он не транскрибируется. В клетках хомяка, трансформированных аденовирусом, последовательности ДНК аденовируса, которые легко расщепляются ДНКазой I, представляют собой участки, с которых транскрибируется мРНК. Другие вирусные последовательности резистентны к этой нуклеазе [119]. Из приведенных наблюдений следует, что во время транскрипции происходят конформационные изменения в хроматине, так что ДНК становится более чувствительной к ДНКазе I, но ее чувствительность к стафилококковой нуклеазе остается прежней. Полученные результаты подтверждаются данными электронной микроскопии [313]. Показано, что в процессе развития ооцитов трех видов Xenopus транскрипционно активный ядрышковый хроматин выглядит гладким, нуклеосомы в нем присутствуют в небольшом количестве или вообще отсутствуют. Неактивный хроматин имеет вид бусин. Пониженная транскрипционная активность хроматина коррелирует с появлением бусин в его структуре, тогда как транскрипционно активный хроматин содержит больше мононуклеосом, чем транскрипционно неактивный, что и означает увеличение той области хроматина, которая активна при транскрипции [223]. Электронно-микроскопическое изучение активно транскрибируемых рибосомных генов Physarum polycephalum показывает, что ДНК в транскрибируемом участке имеет вытянутую конформацию [179]. Таким образом, структура хроматина и, в особенности, нуклеосом подвержена конформационным изменениям в процессе транскрипции, а возможно, и репликации. Не исключено, что это вызвано связыванием с НГБ. Для ковалентной модификации гистонов различных типов, па-пример фосфорилирования, ацетилирования, метилирования и ADPрибозилирования, необходимы эффекторы.

Негистоновые хромосомные белки

Белки, связанные с ДНК эукариотов и отличающиеся от гистонов, называют негистоновыми хромосомными белками (НГБ). Они были открыты в 1946 г. Мирским и Поллистером [251]. От ДНК их отделяют с помощью смеси 2 М NaCl и 5 М мочевины. К ним относятся белки, ответственные за экспрессию и репрессию генов хроматина, а также за метаболизм и модификации хромосомных белков [112]. Они имеют изоэлектрические точки от 3,7 до 9,0. Эти белки весьма неоднородны по размеру — их молекулярная масса может составлять от ~8000 до нескольких сотен тысяч. Период полужизни НГБ сильно варьирует, но в целом он много короче, чем у гистонов. Как и гистоны, они синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядра, где образуют комплексы с ДНК [366]. Если ввести НГБ в цитоплазму, они быстро проникают в ядра [378]. Клетки с более высокой метаболической активностью содержат большее количество НГБ, и этим последние отличаются от гистонов, содержание которых одинаково в клетках всех типов. НГБ присутствуют в хроматине всех тканей, но структура их в разных тканях различна как в количественном, так и в качественном отношении, т. е. эти белки ткане- и видоспецифичны. С помощью методов с высоким разрешением показано, что в каждой ткани имеются сотни типов НГБ. В глиальных клетках с помощью изоэлектрофокусирования и микродиск-электрофореза было обнаружено почти 1500 НГБ [211]. По всей вероятности, некоторые из них представляют собой модифицированные НГБ, причем они синтезируются в течение всего клеточного цикла, тогда как гистоны синтезируются только в S-фазе.

После обработки хроматина тимуса теленка 0,3 М NaCl НГБ по подвижности в геле делятся на две группы: высокоподвижная группа (HMG, от англ. high mobility group) с мол. массой менее 30000 и малоподвижная группа с мол. массой более 30000 [176–178]. К HMG-белкам относятся четыре белка с большим зарядом: HMG1 HMG2, HMG14 и HMG17. Они включают 25 % основных и 30 % кислотных остатков и составляют только 3 % веса ДНК; они присутствуют во всех тканях и не являются тканеспецифичными [297]. Белки HMG ассоциированы с нуклеосомой [134]. Белки HMG1 и HMG2 имеют мол. массу около 26000. Они взаимодействуют с ДНК своими основными остатками [382, 383]. Около 50 % остатков HMG1 заряжены. Необычным является то, что его COOH-концевая область содержит последовательность из 41 чередующихся остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Каждое ядро из тимуса теленка содержит ~106 молекул белков HMG1 [59, 361]. По-видимому, белки HMG играют в хроматине структурную, а не регуляторную роль. Белок HMG1 в отличие от трех остальных не содержит ароматических аминокислот. Он включает последовательность из 89 остатков и имеет мол. массу 9247. Его карбоксильный конец представляет собой цепь кислотных остатков, а NH2-конец — цепь основных остатков; центральная область богата остатками лизина. HMG17 не имеет вторичной и третичной структуры, а по последовательности входящих в него аминокислотных остатков он гомологичен гистонам Н1 и Н5. Его уникальная первичная структура с цепями кислотных и основных остатков указывает на то, что он может быть структурным белком. Показано, что белок HMG17 связывается приблизительно с 57 нуклеотидами ДНК из тимуса теленка и вызывает конформационные изменения в ДНК, сходные с теми, которые производит гистон Н1 [174], причем с ДНК связываются остатки с 15 по 40 [1].

Поскольку белки HMG имеют кислотные и основные остатки, образующие кластеры, они могут связываться с гистонами. своими кислотными группами, а с ДНК — основными остатками. Белки HMG1 и HMG2 ассоциированы с нуклеосомой [29]. Они стабилизируют двойную спираль ДНК, поскольку при ассоциации с ними ее Тm увеличивается на 20 °C [382, 383]. Таким образом, имеются достаточные основания полагать, что белки HMG играют в хроматине структурную роль. При воздействии ДНКазы I на активную часть хроматина белки HMG удаляются. По-видимому, эти белки связаны с нуклеосомами [326]. Дефер и др. [98] также сообщают, что НГБ связаны с нуклеосомами. Существуют экспериментальные доказательства структурной роли некоторых НГБ [7, 8]. Метафазные хромосомы клеток HeLa сохраняют свою морфологию даже после того, как удалены все гистоны и большинство НГБ. Структура поддерживается лишь с помощью ~30 % НГБ, причем в их число входит около 30 типов НГБ с мол. массой ~75000. Каждая хроматида находится в спаренном состоянии, как в метафазе, и остается стабильной даже в 2 М NaCl. Установлено также, что после удаления гистонов из метафазных хромосом их общий размер уменьшается на 50 %, и это не приводит к заметным нарушениям в их морфологии [175]. Отсюда следует, что НГБ ответственны за поддержание метафазной структуры хромосом, а, возможно, также и структур других фаз клеточного цикла. Есть сообщения [44, 265], что НГБ участвуют в процессе закручивания ДНК в сверхспираль и в образовании структуры хроматина высшего порядка. В связи с этим было высказано предположение, что НГБ образуют "строительные леса", или каркас, определяя таким образом основную форму метафазной хромосомы, и в соответствии с этим каркасом ДНК сворачивается в петли.

НГБ очень неоднородны, число их велико, и некоторые из них ткане- и видоспецифичны. Общее содержание НГБ в разных тканях соответствует следующему ряду: мозг>печень>>почки>>селезенка>тимус [255]. Некоторые НГБ специфичны для каждой ткани, а относительные количества индивидуальных НГБ варьируют от ткани к ткани. Они претерпевают количественные и качественные изменения при различных физиологических условиях, а также в процессе эмбриогенеза, дифференцировки клеток и клеточного цикла. Некоторые НГБ слабо связаны с ДНК и легко экстрагируются, другие связаны сильнее. Благодаря своим свойствам они участвуют в регуляции экспрессии генов в целом [202, 285, 325, 332, 347] и в контроле транскрипции в частности [27, 186, 193]. Показано [347], что фракция НГБ из печени крысы стимулирует транскрипцию in vitro. Когда НГБ добавляют к хроматину эмбриона морского ежа, увеличивается число участков инициации синтеза РНК [245]. Аналогичные наблюдения сделаны на клетках асцитного рака Эрлиха: фракция слабо связанных НГБ избирательно ассоциирует с гомологичной ДНК и стимулирует транскрипцию специфических структурных генов в присутствии РНК-полимеразы эукариот [202, 203]. Удалось идентифицировать [203] фосфорилированный НГБ с мол. массой 11000, который ингибирует инициацию транскрипции и играет регуляторную роль в экспрессии генов. Сообщалось также об участии в регуляции специфической активности генов сильно связанных НГБ [40, 82]. Катино и др. [73] изолировали НГБ с мол. массой 31000, который в большом количестве содержится в неделящихся клетках, но в малом количестве — в делящихся, как, например, в гепатоме Новикова. Когда НГБ выделяли из хроматина с помощью 5 М мочевины (М0), смеси 5 М мочевины и 1 М NaCl (M1) и смеси 5 М мочевины и 3 М NaCl (M3) и изучали роль каждой полученной фракции в транскрипции комплекса ДНК — гистон из печени кролика, оказалось, что функции этих трех фракций различны [30]. Фракция М0 стимулирует транскрипцию, связываясь с хроматином и изменяя общую конформацию комплекса ДНК — гистон. Фракция М3 связывается более специфическим образом и раскрывает новые центры для связывания РНК-полимеразы. Фракция M1 включает, по-видимому, структурные компоненты хроматина.

Метаболически более активные клетки содержат большее число НГБ. Обычно НГБ локализованы в тех областях хроматина, которые более активны в процессе синтеза РНК [90, 376]. НГБ способны прекращать репрессию матричной активности, вызываемую гистонами [110, 319]. Некоторые фосфорилированные НГБ специфически взаимодействуют с гистонами Н1 и Н2В и поэтому могут удалять их и открывать участки ДНК для транскрипции [247]. НГБ способны переводить неактивные покоящиеся клетки, находящиеся в фазе G0, в активно растущие в стадии G1. В процессе этого перехода происходит синтез специфических типов НГБ и одновременно увеличивается матричная активность [158, 222, 305]. Отсюда был сделан вывод, что эти белки участвуют в дерепрессии или в положительной регуляции экспрессии генов, особенно в контроле транскрипции в течение клеточного цикла.

При введении цыпленку эстрадиола или прогестерона синтез НГБ в яйцеводе стимулируется. НГБ в яйцеводе крыс, принимавших гормональные препараты, качественно отличны от белков контрольных животных [156]. Полагают, что в ядре акцептором для прогестерон-рецепторного комплекса является НГБ. Глюкокортикоид-рецепторный комплекс лучше связывается с хроматином печени, чем с хроматином тимуса, простаты и матки. Если из хроматина удалить гистоны, то в оставшемся хроматине связывание комплекса увеличивается вдвое. Если же удалить все хромосомные белки, то связывание рецепторного комплекса глюкокортикоида с ДНК уменьшается на 50 %. Отсюда следует, что НГБ ответственны за связывание рецепторного комплекса гормона с ДНК [151]. Синтез НГБ стимулируется кортизоном [14] и глюкагоном [113]. Стероидные гормоны, индуцирующие фосфорилирование НГБ в яйцеводе [88], а также кальцитонин и гормоны паращитовидной железы, которые оказывают противоположное действие на метаболизм кальция в костных клетках, стимулируют фосфорилирование различных НГБ [60].

Экдизон — стероидный гормон, ответственный за развитие насекомых — вызывает образование пуффов в хромосомах слюнных желез у личинок Sciara [133]. Возникновение пуффа указывает на то, что в данном участке происходит транскрипция. В месте пуффа, вызванного действием экдизона, не наблюдается увеличения содержания гистонов или ДНК, в то время как содержание НГБ почти удваивается. Пуффы образуются лишь после окончания определенной стадии развития, когда клетки становятся компетентными (17-дневные личинки); они не появляются у 4-дневных личинок. Это свидетельствует о том, что для действия экдизона необходим какой-то цитоплазматический фактор, вероятно белок. Следовательно, прежде чем экдизон сможет оказать воздействие на специфические гены, должен быть активирован определенный ген, ответственный за синтез этого белка. При возникновении пуффов в политенных хромосомах Drosophila отношение белков к ДНК увеличивается с 6 до 16, количество РНК увеличивается вдвое, а Тm данного участка понижается на 10 °C [281]. Кроме того, около пуффов накапливаются НГБ. В содержании ДНК и гистонов, связан дается никаких изменений, а большая часть гистонов, связанных с ДНК, оказывается дестабилизированной. Эти наблюдения подтверждаются результатами, полученными с помощью иммунофлуоресценции, согласно которым пуффы, индуцированные в политенных хромосомах Drosophila тепловым ударом, содержат новые НГБ. Очевидно, НГБ ответственны за активацию генов.

Воздействие НГБ на экспрессию специфических генов изучалось рядом исследователей [173, 284, 351]. Когда НГБ клеток HeLa добавляли к хроматину этих клеток в фазе G1, начиналась транскрипция генов гистонов, хотя обычно в этой фазе их экспрессии нет. При воссоединении хроматина в S-фазе клеток W1-38 с S-фазными НГБ наблюдается 500-кратная стимуляция транскрипции генов гистонов, в то же время при воссоединении хроматина печени мыши с S-фазными НГБ клеток HeLa транскрипции генов глобина не происходит. Эксперименты по реконструкции с использованием хроматина эритроцитов цыпленка показали: для того чтобы вызвать транскрипцию генов глобина, определенная фракция НГБ должна связываться с ДНК раньше, чем с гистоном [124]. После того как удалось разделить хроматин клеток тимуса теленка и костного мозга на ДНК, гистоны и НГБ, полученные компоненты были использованы в опытах по реконструкции [131]. Оказалось, что в случае клеток тимуса синтезированные РНК похожи на РНК тимуса, а мРНК глобина не синтезируются. Когда же был реконструирован и использован для транскрипции хроматин костного мозга, мРНК глобина синтезировались. Вместе с тем если в реконструкции участвовали ДНК и гистон тимуса и НГБ костного мозга, то также происходил синтез мРНК глобина. Отсюда следует, что НГБ, вероятно, участвуют в регуляции специфических генов. В культуре клеток мышц НГБ активно фосфорилируются главным образом во время дифференцировки [221]. Установлено также, что НГБ принимают участие в положительном контроле экспрессии генов. Однако для того, чтобы идентифицировать специфические компоненты НГБ, участвующих в контроле, и установить точный механизм контроля, необходимы дальнейшие исследования.

Модификации хромосомных белков

Посттрансляционная ковалентная модификация происходит в боковых группах аминокислотных остатков нескольких белков [357]. Хромосомные белки — как гистоны, так и НГБ — синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядро, где они связываются с ДНК. Эти белки, особенно гистоны, подвергаются разнообразным посттрансляционным ковалентным модификациям: фосфорилированию, ацетилированию, метилированию и ADPрибозилированию. Ацетилирование NH2-концевого серинового остатка гистонов Н1, H2A и Н4 происходит во время трансляции и представляет собой стабильную модификацию [229]. Ацетилирование внутренних лизиновых остатков гистонов Н3 и Н4 и фосфорилирование внутренних сериновых остатков происходит в цитоплазме. Затем эти гистоны переходят в ядра и связываются с ДНК [308]. Ацетилирование внутренних лизинов обратимо. Кроме того, обратимая модификация лизиновых остатков происходит уже после связывания гистонов с ДНК. Путем ковалентных модификаций четырех типов изменяются ионный состав гистонов и их стерические свойства, а следовательно, и взаимодействие с ДНК (рис. 2.4).

Рис. 2.4. Структура хроматина с указанием центров связывания гистонов и НГБ с ДНК. Представлены ковалентные модификации гистонов, в результате которых изменяется их связывание с ДНК

При таких модификациях, как фосфорилирование и ADPрибозилирование, число отрицательных зарядов на гистонах увеличивается, и это может привести к их отделению от ДНК, в результате чего становится возможной ее транскрипция или репликация. При ацетилировании общий положительный заряд на гистонах уменьшается. Это также может приводить к их отделению от ДНК. Вместе с тем при метилировании положительный заряд на молекулах гистонов может увеличиваться, что приводит к более сильному связыванию их с ДНК и, как следствие, к подавлению активности генов. Специфические аминокислоты подвержены специфическим модификациям. Определенные модификации преимущественно происходят в определенных гистонах и к тому же на специфических фазах клеточного цикла и роста клетки. Таким образом, не исключено, что модификации боковых групп хромосомных белков являются механизмом тонкой регуляции экспрессии генов. В табл. 2.3 приведены некоторые характеристики этих модификаций.

Таблица 2.3. Параметры ковалентных модификаций цепей гистонов

Фосфорилирование

Фосфорилирование хромосомных белков представляет собой энергозависимую постсинтетическую модификацию. Оно происходит как в цитоплазме, так и в ядре [273, 276, 308]. Орд и Стокен [275] продемонстрировали включение в гистоны 32P in vivo. Позднее было показано, что гистон Н1 фосфорилируется в большей степени, чем другие гистоны [23]. Главными центрами фосфорилирования с помощью специфических с АМР-зависимых протеинкиназ являются боковые группы сериновых и треониновых остатков гистонов и НГБ. Лизиновые, гистидиновые и аргининовые остатки фосфорилируются в малой степени. Киназы присутствуют во фракции НГБ хроматина. В фосфорилировании специфических центров, по-видимому, участвуют специфические гистоновые киназы. Из хроматина тимуса быка удалось выделить АМР-зависимую киназу, которая фосфорилирует единственный центр в гистоне Н3 [321]. Дефосфорилирование этих остатков производится фосфатазами, которые также присутствуют во фракции НГБ. Надежно установлено, что фосфорилирование и дефосфорилирование ферментов являются одним из основных механизмов регулирования их активности, поскольку эти модификации, вызывая конформационные изменения, переводят ферменты из активного состояния в неактивное, и наоборот [137]. При подобных модификациях в молекулах хромосомных белков происходят структурные изменения, которые могут приводить к функциональным изменениям хроматина. Реакция фосфорилирования — дефосфорилирования гистона показана ниже:

В молекулах хромосомных белков обнаружены два типа присоединения фосфатных групп [79]. Один из них, включающий связь Р-О, характерен для сериновых и треониновых остатков, причем эта связь устойчива по отношению к кислоте. Второй тип включает связь P-N, которая образуется в лизиновых, гистидиновых и аргининовых остатках. Эта связь неустойчива в кислых средах.

Фосфорилирование гистонов

Процесс фосфорилирования — дефосфорилирования внутренних остатков хромосомных белков совершается с большой скоростью. Быстрое фосфорилирование наблюдается не только в делящихся, но и в неделящихся клетках после их стимуляции различными эффекторами. В основном фосфорилированию подвержен гистон Н1, т. е. фосфорилирование гистонов, по-видимому, не влияет на транскрипционную активность хроматина.

Центры фосфорилирования гистона Н1 различны на разных стадиях клеточного цикла. Ser-37 фосфорилируется в фазе G1, Ser-114 в фазах S и G2, Ser-180 — в фазе М [206]. По-видимому, это объясняется множественностью Н1-киназ, каждая из которых специфична. Было показано, что быстрорастущие клетки содержат специфичную гистон-киназу, которая катализирует фосфорилирование треониновых остатков, но не Ser-37 и Ser-105 [216]. При фосфорилировании одного из остатков Ser-37 и Ser-105 или обоих степень связывания гистона Н1 с ДНК значительно уменьшается [299]. Такие различия в свойствах разных центров фосфорилирования могут объяснять функциональную роль гистона Н1 в конденсации хроматина. При фосфорилировании различных центров хроматин деконденсируется различным образом, благодаря чему открываются разные участки ДНК.

Показано, что фосфорилирование гистонов связано с изменениями в структуре хроматина особенно во время митоза [140, 143, 144]. Высокая скорость фосфорилирования наблюдается во время митоза клеток яичника китайского хомячка. Такие же модификации наблюдаются в клетках HeLa [209, 210]. Центры фосфорилирования гистона Н1 при митозе (Him) отличаются от центров во время интерфазы (НИ) [25, 162., 209]. Было выдвинуто предположение, что фосфорилирование гистона Н1 необходимо для конденсации интерфазного хроматина в хромосомы. Это совпадает с данными, согласно которым трижды фосфорилированный гистон Н1 связывается с ДНК сильнее, чем дефосфорилированный [196]. У слизистого гриба Prysarum polycephalum фосфорилирование гистона Н1 увеличивается в середине фазы G2 и резко нарастает вплоть до профазы [253]. Дефосфорилирование происходит в последней стадии митоза.

Фосфорилирование различных центров наблюдается также у гистона Н3, но оно не обнаружено у гистонов Н2А, Н2В и Н4. В детальных исследованиях фосфорилирования гистонов Н1 и Н3 из яичника китайского хомячка в процессе митоза было показано, что у большинства клеток эукариот 2–4 центра в гистоне Н1 фосфорилируются в фазе S и дополнительные центры во время митоза (М) [25]. Центры фосфорилирования в фазах S и М, по-видимому, независимы. Более того, эти центры отличаются от тех, которые участвуют в ответе на действие гормона [216]. На ранних стадиях препрофазы, когда начинается агрегация хроматина, гистон Н1 имеет 1–3 фосфатные группы на молекулу, а гистон Н3 не фосфорилируется [95, 140]. Во время промета- и анафазы, когда хроматин агрегирует, все молекулы гистона Н1, а также Н3 суперфосфорилируются и имеют 3–6 фосфатных групп на молекулу. Это может быть обусловлено 6-10-кратным увеличением в митотических клетках содержания специфической АТР-гистон-фосфотрансферазы [209, 210]. Благодаря суперфосфорилированию фибриллы хроматина способны скручиваться в сверхспирали. В телофазе, когда хроматин дезагрегирует, оба гистона, Н1 и Н3, дефосфорилируются. Когда клетки вступают в фазу G1, гистон Н1 полностью дефосфорилируется. Таким образом, суперфосфорилирование гистона Н1m и фосфорилирование гистона Н3 являются митотическими событиями, которые происходят только тогда, когда хромосомы полностью конденсированы. Следовательно, для конденсации хроматина во время митоза необходима высокая степень фосфорилирования гистонов Н1 и Н3, тогда как дефосфорилирование ограничивает этот процесс в интерфазе. Удивляет, однако, тот факт, что при высокой степени фосфорилирования, когда, казалось бы, должна была происходить диссоциация комплекса гистонов Н1 и Н3 с ДНК из-за увеличения отрицательных зарядов на них, наблюдается увеличение конденсации. Для того чтобы выяснить фундаментальный механизм, с помощью которого происходят конденсация и деконденсация хромосом, необходимы дальнейшие исследования. В печени крысы в период развития фосфорилирование гистона Н1 значительно, но оно пренебрежимо мало в печени взрослых животных [22]. Однако фосфорилирование усиливается, когда клетки печени делятся после частичной гепатэктомии [24]. Показано, что в этих условиях отношение числа связей P-O к P-N в печени меняется [79]. P-N-связи обнаруживаются главным образом в гистонах Н1 и Н4. Содержание Hl-киназы на протяжении клеточного цикла не меняется, но количество Н4-киназы увеличивается во время синтеза ДНК. Гистон Н4 также максимально фосфорилируется в фазе S, примем центрами атаки являются гистидиновые остатки. Таким образом, в результате фосфорилирования гистон Н4 может отделяться от ДНК, что способствует ее репликации. Отсюда можно, по-видимому, заключить, что фосфорилирование гистонов необходимо для репликации ДНК, за которой следует деление клетки [26, 161]. Показано, что транскрипция изолированных нуклеосом печени крысы после фосфорилирования усиливается [278]. Фосфорилированный и нефосфорилированный гистоны Н1 отличаются друг от друга по способности подавлять матричную активность хроматина [365]. С помощью метода кругового дихроизма было обнаружено, что фосфорилированные гистоны обладают измененной конформацией [6]. Этим может объясняться тот факт, что модифицированные гистоны вызывают дерепрессию хроматина.

Гистон Н5 также подвержен фосфорилированию. В эритроцитах птиц гистон Н5 фосфорилируется вскоре после его синтеза и затем дефосфорилируется по мере созревания клетки [335]. В отличие от других гистонов гистон Н5 дефосфорилируется в период инактивации генома и конденсации хромосом. Фосфорилированный гистон Н5 не так эффективно вызывает изменение конформации ДНК, как его дефосфорилированная форма. Фосфорилированные остатки (серии) обнаруживаются в областях гистона Н5, имеющих сильноосновный характер и связанных с ДНК. 50 % фосфатов находится в области 1-28, а остальные — на участке 100–200. В процессе сперматогенеза у некоторых видов млекопитающих протамины претерпевают фосфорилирование — дефосфорилирование, что, по-видимому, необходимо для упаковки ДНК [242].

Фосфорилирование НГБ

НГБ фосфорилированы в высокой степени и содержат как P-O-, так и P-N-связи. Полагают, что их фофорилирование катализируют киназы, отличные от тех, которые катализируют фосфорилирование гистонов. Существенным для фосфорилирования является содержание протеинкиназ и сАМР [180]. Кальцитонин стимулирует фосфорилирование НГБ костных клеток в культуре, особенно белков с малой молекулярной массой (10000-45000), но подавляет фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Вместе с тем гормон паращитовидной железы стимулирует фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Таким образом, два пептидных гормона, противоположным образом влияющие на метаболизм кальция, могут реализовать свое действие с помощью фосфорилированных НГБ. Стероидные гормоны также индуцируют фосфорилирование НГБ [88, 183].

Фосфорилирование НГБ зависит от типа клеток и их физиологического состояния [191]. Скорость этого процесса в синхронизированных клетках HeLa in vitro меняется, причем самая большая скорость наблюдается в фазах G1 и S. Когда покоящиеся клетки LC начинают быстро размножаться, одним из самых ранних событий является фосфорилирование НГБ. При добавлении к ядрам клеток печени крыс полиаминов, спермина и спермидина активность протеинкиназы ядер повышается в 2–3 раза, а скорость фосфорилирования НГБ — во много раз [115]. У Physarlum полиамины стимулируют фосфорилирование нескольких уникальных НГБ [19].

В отличие от фосфорилированных гистонов, которые влияют на структуру хроматина, фосфорилированные НГБ участвуют в экспрессии генов [284, 306, 332, 351]. Фосфорилированные НГБ клеток HeLa в фазе G1 стимулируют транскрипцию генов гистона в фазе G1, хотя в данной фазе эти гены не активны. Фосфорилированные НГБ усиливают транскрипцию, а дефосфорилированные уменьшают ее [85, 270]. Механизм этого воздействия, вероятно, заключается в непосредственном взаимодействии белков с ДНК. Такой вывод вытекает из следующих наблюдений: НГБ обладают различной способностью к фосфорилированию, способ их фосфорилирования зависит от типа ткани; при изменениях в их фосфорилировании изменяются структура хроматина и активность генов, а фосфорилированные НГБ специфически связываются с ДНК. НГБ клеток карциномы молочной железы в стадии зависимого от гормона роста и во время регрессии фосфорилируются по-разному [83]. Когда хроматин фибробластов W1-38 человека реконструируют из ДНК и нефосфорилированных или фосфорилированных НГБ, в последнем случае степень транскрипции много больше [295].

Ацетилирование

Есть сообщение о наличии у гистонов ацетильных групп [288]. Ацетилирование гистонов в изолированных ядрах впервые было описано Олфри с сотрудниками [13]. В гистонах обнаружены ацетилированные аминокислотные остатки двух типов: а) NH2-концевой серии гистонов Н1, Н2А и Н4 ацетилируется в N-ацетилсерин; это необратимая постсинтетическая модификация, катализируемая ферментом, содержащимся в цитозоле; б) ацетилированные внутренние лизиновые остатки образуются в результате постсинтетической реакции, протекающей в цитозоле [308] и в ядре после того, как гистоны переходят из цитозоля в ядро и связываются с ДНК [65]. Ацетилирование внутренних остатков в гистоне Н1 либо незначительно, либо вообще отсутствует. Ацетилируется один центр в гистоне Н2А и по четыре центра в каждом из гистонов Н2В, Н3 и Н4. Ацетилирование лизиновых остатков катализируется ацетилтрансферазой, являющейся компонентом НГБ. ε-NH2-группы внутренних лизиновых остатков, расположенных на NH2-концах половины гистонов, ацетилируются с образованием ε-N-ацетиллизина [11, 101, 130], причем в одной молекуле может содержаться до четырех ацетильных групп. Это энергозависимая реакция, в которой источником ацетильной группы является ацетил-CoA. Деацетилирование катализируется деацетилазой, которая также присутствует в хроматине. Схема реакции приведена ниже:

Ацетилируются внутренние лизиновые остатки 9, 14, 18 и 23 гистона Н3 и 5, 8, 12 и 16 гистона Н4 [67, 99]. Эти остатки расположены в NH2-концевой области полипептидной цепи, которая является сильно основной и взаимодействует с кислотными группами ДНК. Ацетилированные гистоны связываются с ДНК менее эффективно, чем деацетилированные [6]. Ацетилирование внутренних лизиновых остатков — процесс обратимый и происходит весьма быстро при самых разных условиях. Период полупревращения реакции ацетилирования очень мал и составляет всего около 3 мин [172, 267]. Были изолированы две гистон-ацетилтрансферазы, имеющие различные оптимумы рН. Ацетилирование ингибируется ионами Mn2+. Этот факт представляется важным, поскольку двухвалентные катионы необходимы для функционирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы. сАМР, влияющая на фосфорилирование, не действует на ацетилирование [33]. Максимальная скорость ацетилирования достигается в интерфазе, по мере вхождения клеток в митоз она уменьшается. Минимальная скорость реакции наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы в наибольшей степени конденсированы [95]. По мере того как клетки входят в телофазу и хромосомы увеличиваются в размере, скорость ацетилирования гистона Н4 увеличивается. Минимальный синтез РНК наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы сильно конденсированы. Важно, что ацетилирование гистона Н4 также минимально именно в этих двух фазах клеточного цикла [33]. Ацетилирование гистонов Н3 и Н4 в эритробластах птиц уменьшается по мере их превращения в зрелые эритроциты, в которых хроматин сильно конденсирован и неактивен ни в транскрипции, ни в репликации [309]. Таким образом, деацетилирование гистонов коррелирует с ингибированием транскрипции, и наоборот, ацетилирование стимулирует транскрипцию. Так как при ацетилировании нуклеосомных гистонов уменьшается их положительный заряд, они могут отделяться от ДНК, благодаря чему ДНК делается доступной для транскрипции.

Если хроматин депротеинизируется, то его транскрипция усиливается [167]. Показано, что при стимуляции синтеза РНК в лимфоцитах митогенами [289], в тканях-мишенях — гормонами [228] и в печени — после частичной гепатэктомии [290] сначала происходит ацетилирование гистонов. В результате ацетилирования нуклеосомных гистонов усиливается транскрипция хроматина тимуса теленка [241]. Если гистоны Н2А и Н2В добавить к ДНК, лишенной хроматина, то транскрипция подавляется. Однако если эти два гистона затем ацетилируются, то репрессия прекращается. При ацетилировании гистонов Н3 и Н4 также наблюдается стимуляция транскрипции. Показано, что ацетилирование предшествует увеличению синтеза РНК [308]. Ацетилирование гистонов происходит не только в делящихся, но и в неделящихся клетках, в которых значительная часть хроматина неактивна в отношении транскрипции [66]. Ацетилирование гистонов стимулирует удлинение цепей при транскрипции [241]. Возможно, что транскрипция генов, которые специфически "включаются" эффекторами, контролируется степенью ацетилирования гистонов и (или) НГБ.

Приведенные выше заключения подтверждаются следующими фактами. Транскрипционно неактивный гетерохроматин инфузорий имеет низкую степень ацетилирования, тогда как эухроматин транскрипционно активен и сильно ацетилирован [232]. Транскрипционно активные макроядра Tetrahymena pyriformis содержат ацетилированные гистоны, тогда как в репрессированных микроядрах их нет [136]. Активные материнские хромосомы червеца содержат значительно больше ацетильных групп, чем неактивные отцовские хромосомы [34]. В исследованиях, выполненных на клетках Drosophila в культуре [227], показано, что 14С-ацетат включается главным образом в гистоны Н3, Н4 и Н2В, а 32Р-фосфат — в гистоны Н1, Н3 и Н4. Самое высокое содержание как 14С-ацетата, так и 32Р наблюдается в гистоне Н3. Когда матрично активные и матрично неактивные области хроматина разделяли после его переваривания ДНКазой II, было обнаружено, что первые содержат большее количество обеих меток (14С и 32Р). Эти данные подтверждают предположение, что различия между транскрибируемыми и нетранскрибируемыми областями хроматина отчасти объясняются специфическими модификациями гистонов в определенных локусах.

Степень ацетилирования гистонов из клеток семенника форели изучали путем инкубирования их с 14С-ацетатом [96]. Гистоны Н2А, Н2В и Н3 ацетилируются в одном положении, в то время как гистон Н4 — в одном, двух, трех и четырех положениях. Когда нуклеосомы, полученные после ацетилирования, обрабатывали трипсином, при этом удаляли NH2-концевые области четырех гистонов, содержащие лизиновые остатки и связанные с ДНК. Эти лизиновые остатки как раз и были ацетилированы. Если нуклеосомы затем расщепляли нуклеазой, то освобождались фрагменты ДНК, обычно при наличии NH2-концевых областей устойчивые к нуклеазе [368]. Ацетилирование приводит к увеличению скорости расщепления хроматина ДНКазой I [268, 362]. Хроматин, содержащий высокоацетилированные гистоны, легче расщепляется ДНКазой I, но не микрококковой нуклеазой [244]. Когда хроматин из семенника форели гидролизовали ДНКазой II, получали транскрипционно активную фракцию, содержащую высокоацетилированный гистон Н4 [97]. Гистоны Н3 и Н4 клеток HeLa сильно ацетилируются при выращивании в бутирате. Нуклеосомная ДНК таких клеток гидролизуется ДНКазой I в 5-10 раз быстрее. При этом ДНК специфически расщепляется в сайте, где в нормальных условиях разрыва не происходит [324]. Показано также [268, 315, 316], что ДНКаза I предпочтительно расщепляет ДНК в тех областях хроматина, которые сильно ацетилированы. По-видимому, нуклеосомы в этих областях после ацетилирования подвергаются конформационным изменениям. Поскольку такие изменения необходимы для того, чтобы РНК- и ДНК-полимеразы могли использовать ДНК в качестве матрицы, не исключено, что ацетилирование представляет собой один из. способов, с помощью которого гистоны частично отделяются от ДНК, благодаря чему последняя становится доступной для ферментов. Таким образом, ацетилирование важно как для функционирования хроматина, так и для его структуры и конформации. Высказано предположение, что гистон Н4 связывается с ДНК по механизму, на первых стадиях которого происходит ацетилирование [236]. Затем может произойти деацетилирование, приводящее к электростатическим взаимодействиям, в результате которых закрепляется конформация. В сперматиде морского ежа, не синтезирующей РНК, гистон Н4 полностью деацетилирован, тогда как в эмбрионе, где наблюдается высокая активность генов, он ацетилирован [53]. Таким образом, между ацетилированием гистона Н4 и активностью хроматина наблюдается прямая корреляция.

Изучению роли ацетилирования гистонов в функционировании хроматина способствовало обнаружение того факта, что в присутствии бутирата эта модификация усиливается и гистоны Н3 и Н4 специфически гиперацетилируются [68, 302, 315], так как бутират ингибирует гистон-деацетилазу. Бутират ингибирует предпочтительно эндогенную деацетилазу гистонов Н3 и Н4 [287], и при этом он не влияет на скорость ацетилирования [41, 68, 300]. По-видимому, гистон-деацетилаза может играть важную роль в метаболическом контроле ацетилирования. При гиперацетилировании гистонов связанная с ними ДНК в клетках HeLa становится более доступной для ДНКазы I, но не для стафилококковой нуклеазы. ДНКаза I способствует также удалению из комплекса гистонов Н3 и Н4 [359]. Одновременно подавляется синтез ДНК [146]. Можно предположить, что ацетилирование гистонов специфически необходимо для транскрипции и не нужно для репликации. В отличие от фосфорилирования, которое характерно для гистона Н1 и только делящихся клеток, ацеталирование протекает главным образом в гистонах Н3 и Н4 и в делящихся, а также неделящихся клетках, которые метаболически активны. Это подтверждает предположение, согласно которому ацетилирование нуклеосомных гистонов играет важную роль в транскрипции. Об ацетилировании НГБ известно очень мало; в одной из работ сообщается, что ацетилируются белки HMG из ядер тимуса теленка и эритроцитов утки [333].

Метилирование

Метилирование гистонов является постсинтетической необратимой модификацией, которая катализируется гистон-метилтрансферазой III, присутствующей во фракции НГБ хроматина. Эта модификация была впервые обнаружена Олфри и сотрудниками [13]. Гистон-метилтрансфераза III катализирует переход СН3-группы из S-аденозилметионина в ε-NH2-группу лизинового остатка, как показано ниже:

Эта модификация гистонов происходит после их связывания с ДНК. Метальные группы гистонов в отличие от фосфорильных и ацетильных групп не вступают в дальнейшие реакции [62, 63]. Вследствие этого метилирование является стабильным процессом. Цитоплазматический фермент — метилаза I метилирует аргинин прежде, чем гистон проникает в ядро [363]. НГБ метилируются особым ферментом. С атомом ε-N-лизинового остатка могут быть связаны одна, две или три метальные группы, которые последовательно вводятся одним и тем же ферментом. Поэтому метиллизиновые остатки могут представлять собой моно-, ди- или триметиллизин. В основном метилируются гистоны Н3 и Н4. В гистоне Н3 соотношение моно-, ди- и триметиллизинов составляет 1,8:1,0:0,45. В гистоне Н4 отношение моно- к диметиллизину равно 0,7:1,0. Таким образом, гистон Н3 метилирован в большей степени, чем гистон Н4. Очищенные гистоны в противоположность гистонам, связанным с хроматином, являются неподходящими субстратами для метилирования. Метилированные гистоны Н3 и Н4 после выделения могут метилироваться и дальше по центрам, отличным от тех, по которым идет реакция для гистонов, связанных с хроматином. Очевидно, эти дополнительные центры недоступны для метилирования из-за специфической конформации в хроматине. Метиллизины расположены вблизи ацетилированных лизинов.

Метилирование гистонов Н3 и Н4 происходит только в NH2-концевой области. Гистон Н3 из тимуса теленка метилируется в Lys-9 и Lys-27, а гистон Н4 — в Lys-20. Оба лизина в гистоне Н3 могут быть моно-, ди- и триметилированы, но в гистоне Н4 триметиллизин не образуется [100, 107, 164]. Гистон Н3 имеет дополнительный центр метилирования — Lys-4. Центры метилирования гистонов Н3 и Н4 так же, как их последовательности аминокислот, чрезвычайно консервативны. Kм и Vmax для метилирования гистонов Н3 и Н4 различны. S-аденозилгомоцистеин — продукт реакции, которую катализирует метилтрансфераза III, — является конкурентным ингибитором субстрата [109, 363].

Метилирование гистонов клеток HeLa происходит главным образом в S-фазе [219]. В культуре ткани метилирование протекает в течение всего клеточного цикла, но максимальная скорость наблюдается между S- и G2-фазами перед началом митоза [320, 350, 352]. Возможно, метилирование необходимо для подготовки хроматина к митозу. После частичной гепатэктомии метилирование гистонов происходит во время важного для клетки периода после S-фазы [218]. Степень метилирования гистонов Н3 и Н4, по-видимому, одна и та же во всех органах, но изменяется с возрастом [107]. У десятидневных крыс молярное соотношение моно-, ди- и триметиллизинов в гистоне Н3 составляет 0,55:1,0:0,35. Молярное соотношение моно- и диметиллизинов в гистоне Н4 в том же возрасте равно 0,1:0,9. С увеличением возраста наблюдается постепенный сдвиг в сторону более метилированных форм. Гистоны Н3 и Н4 в мозгу взрослых крыс не обновляются, так же как не обновляются и их метальные группы независимо от полипептидных цепей [108]. Хонда и др. [165] показали, что метилирование гистонов необратимо и в других тканях. Когда молодым крысам вводили меченый лизин и метионин, значительные количества каждой метки обнаруживали в гистонах мозга. Однако у взрослых особей находили лишь следы этих меток. Если ядра из клеток мозга взрослых крыс инкубировать с S-аденозилметионином, то ни одна метильная группа не включается в гистоны Н3 и Н4. Эти результаты свидетельствуют о том, что метилирование гистонов заканчивается перед наступлением зрелости. Метилированные гистоны могут иметь несколько функций. 1) При метилировании лизиновых остатков, в частности при образовании трифениллизинов, повышается pK ε-NH2-группы лизина и увеличивается основность гистонов. Это может усиливать связь гистонов с ДНК. 2) Метилирование гистонов Н3 и Н4 может играть важную роль в структуре нуклеосом. 3) Метилированные гистоны могут необратимо "запирать" ДНК и препятствовать репликации. Возможно, этим объясняется переход клеток в постмитотическое состояние. 4) Метилированные гистоны могут ингибировать транскрипцию. Для оценки роли метилирования гистонов в структуре и функциях хроматина необходимы дальнейшие исследования.

ADPрибозилирование

Есть сообщения, что поли-ADPрибоза ковалентно связывается с ядерными белками [269, 279]. Было показано, что эта реакция катализируется поли-ADPрибозополимеразой, ассоциированной с хроматином [334]. Молекула фермента из тимуса быка состоит из одной полипептидной цепи с мол. массой 130000; этот фермент полностью активен только в присутствии ДНК [380]. Он связан с межнуклеосомной областью хроматина и, по-видимому, способствует образованию структур хроматина высшего порядка [55]. Субстратом в этой реакции служит NAD+ [56]. Фермент ингибируется никотинамидом, тимидином, цитокининами и метилксантином [226]. В основном ADPрибозилированию как in vivo, так и in vitro подвергается гистон Н1 и до некоторой степени гистон Н2В. Другие нуклеосомные гистоны в печени крыс модифицируются чрезвычайно слабо (если вообще модифицируются) [277, 356]. Центр ADPрибозилирования в гистоне Н1 все еще окончательно не идентифицирован. Было высказано предположение, что он присоединен эфирной связью к глутамату [106]. С помощью фермента в гистон последовательно внедряется от двух до одиннадцати молекул ADPрибозы. Сообщалось о наличии в ядрах клеток из печени крысы разветвленных цепей ADPрибозы, состоящих из 65 остатков [339]. Модификация, по-видимому, происходит следующим образом:

Фосфорилирование серина препятствует ADPрибозилированию [69]. Серии также может быть ADPрибозилирован [277]. Гистон Н6 (белок HMG спермы форели), протамины и некоторые компоненты НГБ также ADPрибозилируются [271, 374, 381]. Связь с ADPрибозой неустойчива в щелочной среде [155]. Поли-(ADPрибозо)гликогидролаза отщепляет полимер от гистона [254]. ADPрибозилированные гистоны легче отделяются от хроматина, чем другие модифицированные гистоны. По-видимому, после ADPрибозилирования связь гистонов с ДНК ослабевает. Это происходит из-за увеличения отрицательных зарядов гистонов и, кроме того, из-за большого размера молекулы, которая способна деформировать структуру хроматина [286]. Функция полимеров ADPрибозы, ковалентно присоединяющихся не только к гистонам, но и к НГБ, еще не установлена. Предполагается, что они участвуют в синтезе и репарации ДНК, в образовании структуры хромосом и в дифференцировке клеток. Содержание ADPрибозополимеразы увеличивается в 3–4 раза в G1-фазе и в процессе дифференцировки эритролейкозных клеток мышей [298]. В клетках HeLa наиболее интенсивное поли-ADPрибозилирование наблюдается в фазе G1, а самое слабое — в фазе S. В результате ADPрибозилирования ядерных белков может происходить их отделение от ДНК, что содействует ее репликации в S-фазе. Таким образом, рассматриваемая модификация может быть необходимой для репликации ДНК. Это подтверждается тем фактом, что синтез ДНК в ядрах, выделенных из печени куриного эмбриона, после ADPрибозилирования увеличивается [341].

Полиамины — спермин, спермидин и путресцин — стимулируют ADPрибозилирование ядерных белков в упомянутом порядке. Стимулирующим эффектом обладает также Mn2+ [340]. ADPрибозилирование гистонов Н1 в клетках HeLa увеличивается в присутствии полиаминов почти в 3 раза [61]. Спермин стимулирует ADPрибозилирование НГБ клеток в культуре, а Mn2+ стимулирует ADPрибозилирование гистонов. Если в инкубационной среде присутствуют и спермин, и Mn2+, то НГБ модифицируются в большей степени, чем гистоны. Таким образом, полиамины и ионы металлов оказывают, по-видимому, регулирующее действие на ADPрибозилирование ядерных белков.

Подводя итоги, можно сказать, что ковалентные модификации хромосомных белков, в частности гистонов, могут оказывать значительное влияние на структуру и функции хроматина. Основные характеристики модифицирующих реакций показаны на рис. 2.4 и заключаются в следующем. 1) Фосфорилирование и ADPрибозилирование происходят в основном в гистоне Н1, а ацетилирование и метилирование — в нуклеосомных гистонах. 2) Фосфорилирование, ADPрибозилирование и ацетилирование приводят к уменьшению общего положительного заряда гистонов и к отделению их от ДНК, тогда как метилирование ведет к увеличению положительного заряда, что делает связь с ДНК более сильной. 3) Гистоны могут претерпевать все эти изменения одновременно, что приводит к значительным изменениям их ионной структуры. 4) Фосфорилирование, очевидно, представляет собой общее явление: оно менее специфично по сравнению с другими модификациями и происходит в делящихся клетках в течение всего клеточного цикла. По-видимому, фосфорилирование необходимо для репликации ДНК и деления клеток. Три другие модификации, вероятно, более специфичны. Ацетилирование происходит главным образом в метаболически активных клетках и, по-видимому, включено в процесс транскрипции. Метилирование, будучи необратимым процессом, может быть важным для репрессии активности генов и для дифференцировки. 5) Все эти модификации специфически модулируются специальными эндогенными эффекторами, в том числе гормонами. Специфические и дифференциальные модификации хромосомных белков могут происходить в разные периоды жизни и приводить к избирательной экспрессии генов.

В то время как накоплено значительное количество данных о ковалентных модификациях гистонов, о подобных модификациях НГБ известно относительно мало. Скудна также информация о скоростях и последовательности дефосфорилирования, деацетилирования и де-ADPрибозилирования.

Модуляция модификаций хромосомных белков

Описанные выше реакции хромосомных белков катализируются специфическими ферментами. Поэтому факторы, изменяющие содержание, и активность этих ферментов, могут также изменять степень этих модификаций и, следовательно, структуру и функции хроматина. Кроме того, скорость и глубина модификаций, особенно тех, которые, подобно фосфорилированию и ацетилированию, характеризуются высокой обратимостью, могут регулироваться фосфатазами и деацетилазами соответственно. Содержание и активность этих ферментов в свою очередь контролируются набором других эффекторов.

Фосфорилирование хромосомных белков осуществляется протеинкиназами, которые обычно активируются сАМР. По-видимому, эти протеинкиназы имеют различную специфичность не только по отношению к гистонам и НГБ, но и по отношению к различным центрам гистонов. Протеинкиназы активируются сАМР, который синтезируется с помощью аденилатциклазы. Содержание сАМР зависит от фосфодиэстеразы (рис. 5.2). Таким образом, изменения в содержании и активности одного или нескольких ферментов влияют на скорость и уровень фосфорилирования [137]. Кроме того, уровень фосфорилирования регулируется также содержанием фосфатаз. Свойственна ли фосфатазам специфичность, как протеинкиназам, неизвестно.

Фосфорилирование хромосомных белков катализируется специфическими протеинкиназами, которые стимулируются сАМР in vitro [213] и in vivo [214]. сАМР-зависимая протеинкиназа из молочной железы коровы фосфорилирует гистоны, богатые лизином, но неактивна в отношении гистонов, богатых аргинином [28]. Кальций ингибирует аденилатциклазу, и поэтому в его присутствии содержание сАМР уменьшается [38]. Вместе с тем он стимулирует гуанилатциклазу и увеличивает содержание cGMP [132]. Поэтому изменение содержания кальция может приводить к изменению содержания циклических нуклеотидов, что в свою очередь может оказывать влияние на активность протеинкиназ и, следовательно, на степень фосфорилирования белков [204]. Содержание кальция в крови и тканях в различных физиологических условиях различно, причем оно изменяется с возрастом [246]. От него зависит фосфорилирование хромосомных белков. В экспериментах in vitro показано, что кальций ингибирует фосфорилирование гистонов из полушарий большого мозга и стимулирует фосфорилирование НГБ [182]. Кальций, будучи катионом, способен вытеснять гистоны из хроматина, взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК [76] и, таким образом, изменять ее матричную активность. Как одновалентные, так и двухвалентные катионы (Na+, K+ и Mg2+) ингибируют фосфорилирование гистонов [256], причем ингибирование Mg2+ следует из того, что он связывается с АТР. Было показано, что Zn2+ способствует образованию аномально высокого количества фосфорилированного гистона Н1, ингибируя активность Н1-гистон-фосфатазы [324].

На фосфорилирование хромосомных белков влияют некоторые стероиды [234]; гидрокортизон, например, стимулирует их фосфорилирование [364], причем он усиливает фосфорилирование гистонов, богатых как лизиновыми, так и аргининовыми остатками [264]. Дексаметазон стимулирует фосфорилирование гистонов Н1 и Н2А клеток HeLa в G1- и S-фазах. Стимулирующий эффект в большей степени проявляется у гистона Н2А [292]. Гидрокортизон повышает степень фосфорилирования НГБ в дискретных хромосомных локусах, вслед за чем увеличивается синтез РНК [314]. Эстрадиол стимулирует синтез специфических НГБ в матке [346]. Это подтверждается экспериментами [88], в которых обнаружено, что увеличение фосфорилирования НГБ происходит, по крайней мере частично, в результате повышения активности ядерной протеинкиназы.

Под действием пептидных гормонов увеличивается содержание сАМР, и поэтому стимулируется фосфорилирование Ser-37 гистона Н1 [43, 215]. В результате такого специфического фосфорилирования гистона Н1 усиливается транскрипция хроматина из тимуса теленка [121]. Тиротропин также стимулирует фосфорилирование гистона Н1 [212].

Полиамины — спермин и спермидин, принимающие участие в делении и росте клеток, стимулируют фосфорилирование НГБ [171]. Когда с помощью фитогемагглютинина стимулировали деление лимфоцитов, на начальных стадиях происходило фосфорилирование НГБ [192].

Установлено, что гистон Н1 из печени плода фосфорилирован в большей степени, чем у взрослой особи [22]. Клетки печени плода делятся быстрее, чем клетки взрослой особи. Таким образом, имеется, по-видимому, корреляция между фосфорилированием гистона Н1 и делением клеток. Эти результаты подтверждаются тем фактом, что в регенерирующей печени гистон Н1 фосфорилируется в большей степени, чем другие гистоны [317].

Ацетилирование хромосомных белков также модулируется некоторыми факторами. Гидрокортизон стимулирует ацетилирование гистонов и одновременно усиливает синтез РНК [9, 10]. Таким образом, имеется хорошая корреляция между ацетилированием гистонов и активностью генов. Есть данные о том, что эстрадиол усиливает ацетилирование богатых аргинином гистонов из матки крыс [228], а также стимулирует синтез РНК [152]. Так как известно, что эстрадиол стимулирует транскрипцию в некоторых тканях, а ацетилирование гистонов, возможно, необходимо для транскрипции, было изучено влияние эстрадиола на ацетилирование гистонов из срезов головного мозга in vitro [349]. Было показано, что эстрадиол стимулирует ацетилирование как гистонов, так и НГБ, причем особенно сильно он стимулирует ацетилирование гистона Н4.

Гормоны, действие которых реализуется с помощью сАМР, также стимулируют ацетилирование гистонов. Эритропоэтин стимулирует ацетилирование гистонов и синтез РНК в клетках селезенки у мышей с полицитемией [338]. Адреналин также стимулирует ацетилирование гистонов, причем только гистонов Н3 и Н4 [349]. Двухвалентные катионы ингибируют активность гистон-ацетилтрансферазы и, следовательно, ацетилирование гистонов [33, 237]. Этот результат вызывает недоумение, так как хорошо известно, что двухвалентные катионы необходимы для активности ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Есть данные, что цистеин сильно ингибирует ацетилирование гистонов [33]. ЛСД (диэтиламид лизергиновой кислоты) усиливает ацетилирование гистонов из мозга крыс [52].

Показано, что бутират — промежуточный продукт метаболизма жирных кислот — вызывает гиперацетилирование гистонов, причем он специфичен в отношении гистонов Н3 и Н4 [302]. Это осуществляется путем ингибирования гистон-деацетилазы [41, 68], так что если ацетатная группа введена в гистон, то она уже не удаляется. При этом, по-видимому, происходят конформационные изменения в нуклеосомах и увеличивается восприимчивость ДНК к ДНКазе I. Отсюда следует, что стимулирование транскрипции, наблюдающееся после ацетилирования, может объясняться такими конформационными изменениями в нуклеосомах, благодаря которым РНК-полимераза более эффективно связывается с ДНК. Показано также, что с увеличением ацетилирования гистонов Н3 и Н4 синтез ДНК подавляется [146]. Таким образом, ацетилирование гистонов, по-видимому, необходимо для транскрипции, но не для репликации.

Очень мало известно о модуляции метилирования хромосомных белков. Метилирование — процесс стабильный. Так как оно происходит главным образом в гистонах Н3 и Н4 и метильные группы не вступают в дальнейшие превращения, метилирование может играть роль в репрессии специфических генов, которая происходит на стадии дифференцировки. Было бы интересно выяснить, стимулируется ли при деметилировании гистонов активность специфических областей генома.

Есть сообщение, что кортизон усиливает метилирование НГБ в специфических хромосомных локусах [314], тогда как эстрадиол не влияет на метилирование гистонов [348]. Чрезвычайно важно, однако, что эстрадиол сильно ингибирует метилирование ДНК. Цитозин ДНК метилируется с образованием 5-метилцитозина. Такое метилирование может вызвать более сильное связывание ДНК с белками. Следовательно, ингибирование метилирования ДНК эстрадиолом может вызывать отделение ДНК от этих белков и усиливать транскрипцию. Изменения в структуре и функциях хроматина, вызываемые метилированием, требуют дальнейших исследований.

ADPрибозилирование гистонов представляет собой модификацию, в результате которой не только вводятся отрицательные заряды, но может также деформироваться комплекс хроматина. О возможности модуляции этой модификации известно мало. Поскольку это необратимый процесс, как и метилирование, он может быть необходим для дифференцировки и перевода клетки в постмитотическое состояние. Изучение этой модуляции поможет пролить свет на механизм дифференцировки и экспрессии генов.

Возрастные изменения в структуре и функциях хроматина

Схема потока информации у эукариот выглядит следующим образом: ДНК→РНК→Белок. Скорость образования и количество различных белков, необходимых для осуществления специфических функций, может регулироваться на одном или на нескольких этапах: а) транскрипция гетерогенных ядерных РНК(гяРНК) — предшественников на хроматине; б) процессинг гяРНК-предшественников до зрелых мРНК, способных к трансляции; в) трансляция мРНК на рибосомах и г) разрушение белков различными факторами. Кроме того, количество активных и неактивных белков, способных к активированию, может регулироваться путем непосредственной модуляции активности белков, например их фосфорилированием и аденилированием. Транскрипция, которая является первым и главным этапом в приведенной выше последовательности событий, может модулироваться с помощью изменений в структурной организации хроматина. Эти изменения, по-видимому, могут касаться: а) образования нужной конформации ДНК, б) доступности ДНК для ДНК-полимеразы, в) степени ассоциации гистонов и НГБ с ДНК, г) модификаций гистонов и НГБ, изменяющих их ассоциацию с ДНК.

Изменения транскрипции и, следовательно, активности хроматина происходят во время дифференцировки. Когда активно делящиеся миобластные клетки сливаются, чтобы образовать многоядерную неделящуюся клетку мышцы, изменяется структура синтезируемой РНК и уменьшается ее общее количество [377], а образование рибосомной РНК (рРНК) сильно падает [87]. Это подтверждается тем фактом, что количество РНК, гибридизованной с ДНК после слияния клеток, значительно меньше, чем в делящихся клетках. Процентное содержание РНК с уникальными последовательностями оснований после слияния выше. Это указывает на то, что в дифференцированных клетках экспрессия специфических генов выше, чем других генов, в отличие от делящихся, недифференцированных клеток. Таким образом, во время и после дифференцировки происходят как качественные, так и количественные изменения активности хроматина. По-видимому, имеются контролирующие механизмы, воздействующие как на уникальные, так и на повторяющиеся последовательности ДНК. Клетки сердечной мышцы после рождения перестают делиться, и это сопровождается уменьшением транскрипции. Их ДНК становится менее восприимчивой к ДНКазе I, и температура ее плавления повышается [231].

Описанным выше наблюдениям не противоречат данные, согласно которым слияние миобластов сопровождается сильным увеличением активности креатинфосфокиназы (КФК), что указывает на более интенсивную транскрипцию ее мРНК [257, 259, 317а]. Показано, что активность КФК у цыпленка увеличивается в период дифференцировки в 20 раз, и причиной этому служит увеличение количества ММ-изофермента. Отсюда следует, что транскрибируется преимущественно ген М-субъединицы [235]. Другим важным изменением, происходящим во время дифференцировки сердечной мышцы, является полное прекращение синтеза ДНК-полимеразы [86].

Подобные изменения в транскрипционной активности хроматина происходят на стадии эмбриогенеза у амфибий [102] и морских ежей [118]. Качественные изменения наблюдаются и при индуцированной гормонами дифференцировке молочной железы [355]. Механизм, с помощью которого осуществляется дифференциальная экспрессия генов, неизвестен. Вопрос заключается в том, возникают ли изменения в хроматине — структурные и функциональные — после достижения зрелости и ведут ли эти изменения к старению организма. Для того чтобы найти ответ на эти вопросы, многие исследователи изучали разные свойства хроматина в зависимости от возраста.

В ряде работ измеряли температуру плавления (Tm) хроматина из печени и тимуса, и во всех случаях было обнаружено в старческом возрасте увеличение Tm [31,32, 149,208, 274, 296]. С помощью ЭВМ был изучен профиль температуры плавления хроматина; было обнаружено, что гиперхромизм и Tm в старости увеличиваются [297]. Это может объясняться увеличением с возрастом числа ковалентных связей между хромосомными белками и ДНК [147–150]. Данная точка зрения согласуется с тем, что количество белка, которое можно экстрагировать из хроматина с помощью солевого раствора, с возрастом уменьшается [274], а количество одноцепочечных разрывов в ДНК увеличивается [80], так как включение 3Н-тимидина в ДНК с возрастом увеличивается [143, 294, 311]. Показано, что ДНК печени старой мыши (20 мес) более чувствительна к S1-нуклеазе, чем ДНК мыши в возрасте от 1 до 15 мес [81]. При седиментации ДНК из мозга мыши в градиенте щелочной сахарозы образуются четыре полосы для старых животных и одна для молодых, что свидетельствует о деградации ДНК в старческом возрасте в результате одноцепочечных разрывов. Такие разрывы в ДНК могут обеспечивать центры для ее ковалентного связывания с хромосомными белками. Одним из факторов, который, по-видимому, способствует образованию разрывов, является диметилирование цитозина. Сообщается, что небольшая доля (3- 10 %) цитозина ДНК постсинтетически метилируется с образованием 5-метилцитозина [54, 322]. Эта модификация предохраняет данный сайт ДНК от расщепления ферментом рестрикции [37, 128, 304], в частности ферментом Нра II [240, 323]. В результате деметилирования цитозинов эти сайты могут стать восприимчивыми к расщеплению, что приведет к увеличению числа разрывов в ДНК. Известно, что содержание 5-метилцитозина в печени рыб с возрастом уменьшается [358]. Однако показано, что метилирование ДНК, выделенной из полушарий головного мозга крыс, в старости увеличивается [348]. Это может усиливать связь ДНК с гистонами и не только увеличивать Tm хроматина, но и уменьшать его матричную активность. Стабильны ли метильные группы ДНК — неизвестно, но весьма вероятно, что метилирование ДНК осуществляется ферментами, отличными от тех, которые метилируют гистоны.

Изучение гибридизации ДНК — РНК в печени мышей показало, что доля ДНК, которая гибридизуется с уникальными и повторяющимися последовательностями РНК, с возрастом уменьшается [92]. Как отсюда следует, с возрастом уменьшается доля транскрибируемой ДНК, что в свою очередь указывает на увеличение связывания и маскировки ДНК хромосомными белками. С помощью того же метода измерялось число транскрибированных рибосомных генов на гаплоидный геном мыши [126, 127]. В возрасте более 2 лет наблюдалось резкое уменьшение числа транскрибированных генов. Однако у человека подобные изменения не обнаруживаются. Аналогичные методы использовались для количественной оценки процентного содержания транскрибированной сателлитной ДНК в различных тканях мыши [291]. В селезенке, почках и в мозгу изменений не наблюдалось, но в печени с возрастом ее количество увеличивалось.

Несколько исследователей изучали транскрипцию РНК на хроматине в зависимости от возраста. В экспериментах in vitro с использованием срезов печени и мозга было показано, что синтез РНК в этих тканях в старческом возрасте уменьшается [103, 145]. Причиной этого может являться уменьшение количества РНК-полимеразы [51, 239]. Обнаружено, что транскрипционная активность различных тканей в старости уменьшается [274, 296]. Результаты, полученные в опытах in vivo, свидетельствуют о том, что синтез РНК в печени, мозгу, сердце и селезенке крыс в старческом возрасте понижается [181]. С возрастом претерпевают качественные изменения типы синтезируемых РНК, а отношение РНК: белок уменьшается [92]. РНК некоторых типов, синтезируемые в организме в среднем возрасте, в старости исчезают, и появляются молекулы новых типов, которые не синтезируются в репродуктивном периоде. Это напоминает возрастные изменения в наборе изоферментов, например аланинаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы (гл. 3).

Содержание гистонов в клетке каждой ткани остается приблизительно постоянным на протяжении всей жизни [71]. В нуклеосомных гистонах печени и селезенки крыс и мышей количественных и качественных изменений не происходит, но изменяются три субфракции гистона Н1 [248, 249]. Так, в старческом возрасте специфически увеличивается количество субфракции гистона Н1, содержащей метионин. Предстоит выяснить, как это влияет на структуру и функции хроматина. Сообщается, что содержание НГБ и РНК в хроматине крыс с возрастом уменьшается [104, 207].

Хотя гистонов всего несколько и они играют структурную роль, изменения в степени их ассоциации с ДНК могут иметь значение как при транскрипции, так и при репликации. Благодаря различным ковалентным модификациям их ассоциация с ДНК может меняться. Канунго и его сотрудники исследовали in vitro зависимость ковалентных модификаций гистонов от возраста и модуляции этих модификаций различными эндогенными факторами. В опытах использовали срезы коры головного мозга крыс разного возраста. Схема этих исследований показала на рис. 2.5. Было обнаружено, что фосфорилирование гистонов полушарий большого мозга с возрастом уменьшается [182]. В частности, резко уменьшается фосфорилирование гистонов Н1 и Н4. Кальций ингибирует фосфорилирование гистонов, особенно гистонов Н1 и Н4. Этот эффект в старческом возрасте уменьшается (рис. 2.6). Эстрадиол стимулирует фосфорилирование гистонов [183], особенно у взрослых животных, но этот эффект в старости исчезает (рис. 2.7). При уменьшении фосфорилирования гистонов может усиливаться их связь с ДНК благодаря уменьшению числа отрицательных зарядов.

Рис. 2.5. Схема проведения in vitro ковалентных модификаций хромосомных белков и модуляции матричной активности хроматина в срезах коры головного мозга крыс

Рис. 2.6. Влияние кальция на включение 32P в гистоны коры головного мозга крыс-самок разного возраста [182].

А. Норма. Б. Добавлен Са2+

Рис. 2.7. Влияние эстрадиола на включение 32P в гистоны коры головного мозга крыс-самок разного возраста [183].

А. Норма. Б. Добавлен эстрадиол

Ацетилирование гистонов играет роль в транскрипционной активности хроматина. Показано, что ацетилирование гистонов из мозга крыс с возрастом уменьшается [349]. При этом специфическое уменьшение наблюдается для гистонов Н3 и Н4, а ацетилирование гистона Н1 не меняется. Адреналин стимулирует ацетилирование гистона Н1, а эстрадиол — гистона Н3. Эти модулирующие эффекты в старческом возрасте уменьшаются. Кальций не оказывает значительного влияния на ацетилирование гистонов (рис. 2.8).

Рис. 2.8. Влияние кальция и эстрадиола на ацетилирование отдельных гистонов коры головного мозга крыс-самок разного возраста [348, 349].

А. Норма. Б. Добавлен Са2+. В. Добавлен эстрадиол

Было изучено влияние ацетилирования гистонов и его модуляций, вызываемых бутиратом и эстрадиолом, на функции хроматина из коры головного мозга крыс [184]. Как бутират, так и эстрадиол, добавленные в инкубационную среду, содержащую 14С-ацетат и срезы головного мозга, стимулировали ацетилирование гистонов у молодых крыс. Этот эффект сильно уменьшался у взрослых особей и вообще не наблюдался у старых животных (110 нед). Если из этих срезов выделяли ядра и использовали их для транскрипции при инкубировании с 3H-UTP и другими нуклеотидтрифосфатами, то наибольшее стимулирование транскрипции наблюдалось у молодых крыс, а у взрослых этот эффект сильно уменьшался. Изучаемые модуляторы ее оказывают никакого влияния на транскрипцию у старых крыс (рис. 2.9). Полученные данные указывают не только на корреляцию между ацетилированием гистонов и транскрипцией хроматина, но и на уменьшение в старческом возрасте модулирующего влияния бутирата и эстрадиола. Это может быть обусловлено структурными и конформационными изменениями хроматина, появляющимися при увеличении возраста.

Рис. 2.9. Включение 3H-UMP в РНК из ацетилированных ядер коры головного мозга крыс-самок разного возраста и действие масляной кислоты и эстрадиола [184].

1 — срез; 2 — срез после ацетилирования; 3 — срез после ацетилирования + масляная кислота; 4 — срез после ацетилирования + эстрадиол

Изучение метилирования гистонов из мозга крыс показало, что эта модификация с возрастом также замедляется, особенно в случае гистонов Н3 и Н4 (рис. 2.10) [348]. Однако метилирование является стабильной модификацией, и поэтому несмотря на то, что с возрастом происходит замедление включения групп 14СН3, общее число метальных групп в гистонах увеличивается, так как те группы, которые были введены в более раннем возрасте, уже не удаляются. При метилировании гистонов, особенно при образовании триметиллизиновых остатков гистона Н3, их связь с ДНК усиливается. Эстрадиол стимулирует метилирование гистона Н2В, а кальций — гистона Н3. Эти модуляционные эффекты в старческом возрасте отсутствуют. Ковалентные модификации определенных гистонов специфическими эффекторами, несомненно, меняют не только структуру, но и функции хроматина.

Рис. 2.10. Влияние кальция и эстрадиола на метилирование отдельных гистонов коры головного мозга крыс-самок разного возраста [348].

А. Норма. Б. Добавлен Са2+. В. Добавлен эстрадиол

Содержание НГБ с возрастом уменьшается [208, 384]. Метаболически активные ткани содержат больше этих белков, чем неактивные. По-видимому, с уменьшением их количества активность тканей снижается. Электрофорезом НГБ мозга в полиакриламидном геле были показаны не только качественные, но и количественные возрастные изменения во фракциях НГБ [185]. Ковалентные модификации НГБ и их модуляция различными эндогенными эффекторами также зависят от возраста [182, 183, 185, 349]. Показано, что фосфорилирование, ацетилирование и метилирование НГБ мозга в старости очень сильно замедляются. Кальций стимулирует их фосфорилирование как в среднем, так и в старческом возрасте. Однако стимулирующий эффект эстрадиола, наблюдающийся в среднем возрасте, в старости не проявляется (рис. 2.11, 2.12). Кальций не стимулирует ацетилирование НГБ, а эстрадиол и адреналин стимулируют его у молодых крыс, но не оказывают влияния в случае крыс среднего возраста и старых крыс (рис. 2.13). Ни кальций, ни эстрадиол не влияют на метилирование НГБ. Показано, что эти эффекторы модулируют модификацию специфических НГБ [185]. Вероятно, фосфорилирование НГБ более важно для экспрессии генов, чем их ацетилирование и метилирование. Как позволяют предположить эти данные, замедление ковалентных модификаций НГБ в старческом возрасте может происходить из-за того, что соответствующие центры становятся малодоступными. Это в свою очередь может быть обусловлена конформационными изменениями в хроматине вследствие более сильного связывания НГБ с ДНК.

Рис. 2.11. Влияние кальция на фосфорилирование отдельных НГБ коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].

 А. Норма. Б. Добавлен Са2+

Рис. 2.12. Влияние эстрадиола на фосфорилирование отдельных НГБ белков коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].

А. Норма. Б. Добавлен эстрадиол

Рис. 2.13. Влияние кальция и эстрадиола на ацетилирование отдельных НГБ коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].

А. Норма. Б. Добавлен Са2+. В. Добавлен эстрадиол

Функции хроматина самым тесным образом связаны с его структурной организацией, и если структура меняется, то, несомненно, меняются и функции. К функциям хроматина относятся репликация и транскрипция. Показано, что у свободноживущей нематоды Turbatrix aceti, клетки которой не делятся, активность ДНК-полимеразы с возрастом уменьшается [45].

Есть сообщение, что синтез ДНК в постмитотических тканях — в мозгу, сердце и печени — у старых крыс усиливается [294]. Клетки этих тканей не вступают в митоз. Поэтому предполагают, что синтез ДНК в них происходит только в целях репарации ДНК, которая в старческом возрасте в большей степени подвергается расщеплению [80, 81]. В клетках слюнной железы крыс синтез ДНК индуцируется изопротеренолом (изадрином), но лагпериод индукции с возрастом увеличивается, а степень индукции уменьшается [4].

Исследования, выполненные in vitro на клетках фибробластов в культуре, показали, что с уменьшением способности клеток к делению и с увеличением продолжительности клеточного цикла в поздних пассажах (фаза III) активность ДНК-полимеразы уменьшается [360]. Кроме того, в таких клетках наблюдается уменьшение количества репараций ДНК [233].

Резюме

Вся информация в организме заключена в ДНК, которая в комплексе с гистонами и НГБ образует генетический аппарат клетки, называемый хроматином. Гистоны представляют собой основные белки с малой молекулярной массой, богатые лизиновыми и (или) аргининовыми остатками, сконцентрированными в NH2- и COOH-концевых участках. Их структура в ходе эволюции оставалась неизменной. Почти все ткани содержат одни и те же типы и количества гистонов, которые не изменяются на протяжении всей жизни. Имеется пять основных типов гистонов: Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Их гены в хромосоме повторяются несколько раз и сцеплены. Гистоны синтезируются в цитоплазме в течение S-фазы и затем переходят в ядро. Будучи основными, они связываются с ДНК. Гистоны необходимы для структурной организации хроматина. Основная структура хроматина представляет собой цепочку нуклеосом диаметром ∼10 нм. Нуклеосомы имеют внутреннюю сердцевину, состоящую из октамера, включающего по две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, вокруг которого "обернута" ДНК. Гистон Н1 связан с межнуклеосомной ДНК, соединяющей две нуклеосомы, и участвует в создании структуры хроматина более высокого порядка.

НГБ чрезвычайно разнородны, их насчитывают несколько сотен. Эти белки богаты кислыми аминокислотами и обладают видо- и тканеспецифичностью. Метаболически более активные ткани содержат больше типов и большие количества НГБ. Они синтезируются в течение всего клеточного цикла. НГБ участвуют как в структурной организации хроматина, так и в положительной регуляции экспрессии генов.

И гистоны, и НГБ подвергаются различным постсинтетическим модификациям — фосфорилированию, ацетилированию, ADPрибозилированию и метилированию. Если первые три модификации уменьшают положительный заряд гистонов и вызывают их отделение от ДНК, то метилирование усиливает их связывание с ДНК. Эти модификации происходят в определенных гистонах на специфических фазах клеточного цикла и развития организма. Они могут изменять структурную организацию хроматина и его матричную активность. Фосфорилирование относится к процессам, связанным с делением клетки, а ацетилирование — к процессам, связанным с транскрипцией. Метилирование и ADPрибозилирование, по-видимому, происходят во время дифференцировки клеток. Ряд эндогенных эффекторов, таких, как гормоны и ионы металлов, модулируют эти модификации и таким образом модулируют матричную активность хроматина.

С возрастом в хроматине происходят структурные изменения. Его температура плавления (Tm) увеличивается, а экстрагируемость хромосомных белков уменьшается, что указывает на более сильное связывание белков с ДНК. Кроме того, уменьшается степень ковалентных модификаций белков, а также модулирующее влияние эффекторов на эти модификации. Причиной подобных изменений могут быть конформационные изменения, имеющие место в старости. Вследствие этих изменений в некоторых тканях с возрастом трансляционная активность хроматина уменьшается. Эти данные показывают, что структурные изменения хроматина, особенно в постмитотических тканях, в которых он не обновляется, приводят к снижению его матричной активности, а также его реакции на модуляторы. Это может вызывать постепенное ухудшение различных функций организма и вести к старению.

Литература

1. Aberchrombie B. D., Kneale G. G., Crane-Robinson C., Bradbury E. M., Goodwin G. H., Walker J. M., Johns E. W. Eur. J. Biochem., 84, 173–177 (1978).

2. Absolom D., Regenmortel M. H. V. FEBS Lett., 85, 61–64 (1978).

3. Adamson E. D., Woodland H. R. J. molec. Biol., 88, 263–285 (1974).

4. Adelman R. C., Stein G., Roth G. S., Englander D. Mech. Age. Dev., 1, 49 59 (1972).

5. Adesnik M., Darnell J. E. J. molec. Biol., 67, 397–406 (1972).

6. Adler A. J., Fashman G. D., Wangh W., Allfrey V. G. J. biol Chem., 249, 29Ц 2914 (1974).

7. Adolph K. W., Cheng S. M., Laemmli U. K. Cell, 12, 805–816 (1977).

8. Adolph K. W., Paulson J. R., Laemmli U. K. Cell, 12, 817–828 (1977).

9. Allfrey V. G. In: Regulatory Mechanisms for Protein Synthesis in Mammalian Cells (A. San Pietro, M. R. Lamborg and F. T. Kenney, Eds.), Vol. II, 65-100, Academic Press, New York and London (1965).

10. Allfrey V. G. Can. Res., 26, 2026–2040 (1966).

11. Allfrey V. G. Fed. Proc, 29, 1447–1460 (1970).

12. Allfrey V. G. In: Histones and Nucleohistones (Phillips D. M. P., Ed.), pp. 241–294, Plenum Press, New York (1971).

13. Allfrey V. G., Faulkner R., Mirsky A. E. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 51, 786–794 (1964).

14. Allfrey V. G. Shelton K. Nature, 228, 132–134 (1970).

15. Altenburger W., Horz W., Zachau H. G. Nature, 264, 517–522 (1976).

16. Appels R., Ringertz N. R. Cell Diif., 3, 1–8 (1974).

17. Arceci R. J., Gross P. R. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 5016–5020 (1977).

18. Arceci R. J., Senger D. R., Gross P. R. Cell, 9, 171–178 (1976).

19. Atmar V. J., Daniels G. R., Keuhn G. D. Europ. J. Biochem, 90, 29–37 (1978).

20. Bakayev V. V., Bakayeva T. G., Varshavsky A. J. Cell, 11, 619–629 (1977).

21. Baldwin J. P., Boseley P. G., Bradbury E. M. Nature, 253, 245–249 (1975).

22. Balhom R., Balhorn M., Chalkley R. Devi. Biol, 29, 199–203 (1972).

23. Balhorn R., Chalkley R., Granner D. Biochemistry, 11, 1094–1098 (1972).

24. Balhorn R., Reike W. O., Chalkley R. Biochemistry, 10, 3952–3958 (1971).

25. Balhorn R., Jackson V., Granner D., Chalkley R. Biochemistry, 14, 2504–2511 (1975).

26. Bartley J., Chalkley R. J. biol. Chem, 245, 4286–4292 (1970).

27. Baserga R. Life Sci, 15, 1057–1071 (1974).

28. Bear J. L., Zalitis J. G., MacKinlay A. G. Biochem. Biophys. Res. Commun., 84, 450–457 (1978).

29. Beatriz L. W., Dixon G. H. Can. J. Biochem, 56, 480–491 (1978).

30. Bekhor J., Samal B. Arch. Biochem. Biophys, 179, 537–544 (1977).

31. Berdyshev G. D. Interdisciplinary Topics in Gerontology, 10, 70–82, S. Karger, Basel (1976).

32. Berdyshev G. D., Zelabovskaya S. Expl. Gerontol, 7, 321–330 (1972).

33. Berkovic S. F., Mauritzen C. M. Biochim. Biophys. Acta, 475, 160–167 (1977).

34. Berlowitz L., Pallotta D. Expl. Cell. Res, 71, 45–48 (1972).

35. Billett M. A., Hindley J. Eur. J. Biochem, 28, 451–462 (1972).

36. Bina-Stein M. J. biol. Chem, 253, 5213–5219 (1978).

37. Bird A. P., Southern T. M. J. molec. Biol, 118, 27 (1968).

38. Birnbaumer L. Biochim. Biophys. Acta, 300, 129–158 (1973).

39. Birnsteil M. L., Gross K, Schaffner W., Portmann R., Probst E. In: Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus (P. O. P. Ts'o, Ed.), 87–98, North-Holland, Amsterdam (1977).

40. Bluthmann H., Mrozek S., Gierer A. Eur. J. Biochem, 58, 315–326 (1975).

41. Boffa L. C., Vidali G., Mann R. S., Allfrey V. G. J. biol. Chem, 253, 3364–3366 (1978).

42. Böhm L, Hayashi H., Cary P. D., Moss T., Crane-Robinson C, Bradbury E. M. Eur. J. Biochem, 77, 487–493 (1977).

43. Böhm J., Keil G., Knippers R. Eur. J. Biochem, 78, 251–266 (1977).

44. Bokhonko A. I., Razumova V. V. Eur. J. Biochem, 85, 115–120 (1978).

45. Bolla R., Brot N. Arch. Biochem. Biophys., 169, 227–236 (1975).

46. Bradbury E. M. Ciba Foundation Symp, 25, 131–142 (1975).

47. Bradbury E. M., Danby S. E., Rattle H. W. E., Giancotti V. Eur. J. Biochem., 57, 97-105 (1975).

48. Bradbury E. M., Inglis R. J., Mathews H. R., Sarner N. Eur. J. Biochem, 33, 131–139 (1973).

49. Bradbury E. M., Molgaard H. V., Stephens R. M. Eur. J. Biochem, 31, 474–482 (1972).

50. Bram S. Biochem. Biophys. Res. Commun, 81, 684–691 (1978).

51. Britton V. J., Frederick G. S., Florini J. R. J. Gerontol, 27, 188–192 (1972).

52. Brown I. R., Liew C. C. Science, 188, 1122–1123 (1975).

53. Burdic C. J., Taylor B. A. Expl. Cell. Res, 100, 428–433 (1976).

54. Burdon R. H., Adams R. L. P. Biochim. Biophys. Acta, 174, 322–329 (1969).

55. Butt T. R., Brothers J. F., Giri C. P., Smulson M. E. Nucl. Acid Res, 5, 2775–2788 (1978).

56. Burzio L., Koide S. S. Biochem. Biophys. Res. Commun, 42, 1185–1190 (1971).

57. Busch H. (Ed.). The Cell Nucleus. Chromatin Parts A and B, Vol. IV, Academic Press, New York and London (1978).

58. Bustin M., Cole R. D. J. biol. Chem, 243, 4500–4505 (1968).

59. Bustin M., Hopkins R. B., Isenberg I. J. biol. Chem, 253, 1694–1699 (1978).

60. Bustos S. E., Schuster G. S, Dirksen T. R., McKinney R. V., Lai D. Y. L. J. Cell. Physiol, 92, 43–48 (1977).

61. Byrne R. H., Stone P. R., Kidwell W. R. Expl. Cell Res, 115, 227–283 (1978).

62. Byvoet P. Biochim. Biophys. Acta, 160, 217–223 (1968).

63. Byvoet P., Shepherd G. R., Hardin J. M., Noland B. J. Arch. Biochem Biophys, 148, 558–567 (1972).

64. Camerini-Otero R. D., Sollner-Webb B., Felsenfeld G. Cell, 8, 333–347 (1976).

65. Candido E. P. M., Dixon G. H. J. biol. Chem., 247, 3868–3873 (1972).

66. Candido E. P. M., Dixon G. H. J. biol. Chem., 247, 5606–5510 (1972).

67. Candido E. P. M., Dixon G. H. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 69, 2015–2019 (1972).

68. Candido E. P. M., Reeves R., Davie J. R. Cell, 14, 105–113 (1978).

69. Caplan A., Ord M. G., Stocken L. A. Biochem. J., 174, 475–483 (1978).

70. Carter C. W., Jr. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 3649–3653 (1978).

71. Carter D. B., Chae C. J. Gerontol., 30, 28–32 (1975).

72. Cary P. D., Moss T., Bradbury E. M. Eur. J. Biochem., 89, 475–482 (1978).

73. Catino J. J., Yeoman L. C, Mandel M., Busch H. Biochemistry, 17, 983–987 (1978).

74. Chambon P. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 42, 1209–1234 (1978).

75. Champoux J. J. Ann. Rev. Biochem., 47, 449–479 (1978).

76. Chang K. Y., Can C. W. Biochim. Biophys. Acta, 157, 127–139 (1968).

77. Chapman G. E., Aviles F. J., Crane-Robinson C., Bradbury E. M. Eur. J. Biochem., 90, 287–296 (1978).

78. Chapman G. E., Hartman P. G., Cary P. D., Bradbury E. M., Lee D. R. Eur. J. Biochem., 86, 35–44 (1978).

79. Chen C. C., Bruegger B. B., Kern C. W., Lin Y. C, Halpern R. M., Smith R. A. Biochemistry, 16, 4852–4855 (1977).

80. Chetsanga C. J., Boyd V., Peterson L., Rushlow K. Nature, 253, 130–131 (1975).

81. Chetsanga C. I., Tuttle M., Jacoboni A., Johnson C. Biochim. Biophys. Acta, 474, 180–187 (1977).

82. Chiu J. F., Tsai Y. H., Sakuma K., Hnilica L. S. J. biol. Chem., 250, 9431–9433 (1975).

83. Cho-Chung V. S., Redler B. H. Science, 197, 272–275 (1977).

84. Chung S., Hill W. E., Doty P. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 1680–1684 (1978).

85. Chung D. M., Hollenbeck R., Costa E. Science, 193, 60–62 (1976).

86. Claycomb W. C. Biochem. J., 171, 289–298 (1978).

87. Clissold P., Cole R. J. Expl. Cell. Res., 80, 159–169 (1973).

88. Cohen M. E., Kleinsmith L. J. Biochim. Biophys. Acta, 435, 159–166 (1976).

89. Cole R. D. In: Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus (P. O. P. Ts'o, Ed.), Vol. 1, 93-104, North-Holland, Amsterdam (1977).

90. Comings D. E., Harris D. C., Okada T. A., Holmquist G. Expl. Cell. Res., 105, 349–365 (1977).

91. Crawford R. J., Krieg P., Harvey R. P., Hewish D. A., Wells J. R. E. Nature, 279, 132–136 (1979).

92. Cutler R. C. Expl. Gerontol., 10, 37–60 (1975).

93. D'Anna J. A., Gurley L. R., Deaven L. L. Nucl. Acid. Res., 5, 3195–3207 (1978).

94. D'Anna J. A., Isenberg I. Biochemistry, 13, 4992–4997 (1974).

95. D'Anna J. A., Tobey R. A., Barnam S. S., Gurley L. R. Biochem. Biophys. Res. Commun., 77, 187–194 (1977).

96. Davie J. R., Candido E. P. M. J. biol. Chem., 252, 5962–5966 (1977).

97. Davie J. R., Candido E. P. M. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 3574–3577 (1978). o

98. Defer N., Kitzis A., Levy F., Tichonicky L., Sabatier M. N., Kruh J. Europ. J. Biochem., 88, 583–691 (1978).

99. DeLange R. J., Farnbrough D. M., Smith E. L., Bonner J. J. biol. Chem., 244, 319–344 (1969).

100. DeLange R. J., Hooper J. A., Smith E. L. J. biol. Chem., 248, 3261–3274 (1973).

101. DeLange R. J., Smith E. L., Bonner J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 40, 989–993 (1970).

102. Denis H. J. molec. Biol., 22, 285–304 (1966).

103. Devi A., Lindsay N. K., Raina R. L., Sarkar N. K. Nature, 212, 474–475 (1966).

104. Dingman C. W., Sporn M. B. J. biol. Chem., 239, 3483–3492 (1964).

105. Dixon G. H., Davies P. L., Ferrier L. N., Gedamu L., Iotrov K. In: Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus (P. O. P. Ts'o, Ed.), Vol. 1, 335–379, North-Holland, Amsterdam (1977).

106. Dixon G. H., Wong N., Poirier G. G. Fed. Proc, 35, 1623 (1976).

107. Duerre J. A., Chakrabarry S. J. biol. Chem., 252, 8457–8461 (1977).

108. Duerre J. A., Lee C. T. J. Neurochem., 23, 541–547 (1974).

109. Duerre J. A., Wallwork J. C., Quick D. P., Ford K. M. J. biol. Chem., 252, 5981–5985 (1977).

110. Elgin S. C. R., Froehner S. C., Smart J. E., Bonner J. Adv. Cell molec. Biol., 1, 1-57 (1971).

111. Elgin S. C. R., Serunian L. A., Silver L. M. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 42, 839–849 (1978).

112. Elgin S. C. R., Weintraub H. Ann. Rev. Biochem., 44, 725–774 (1975).

113. Enea V., Allfrey V. G. Nature, 242, 265–267 (1973).

114. Evans K., Hohmann P., Cole R. D. Biochim. Biophys. Acta, 221, 128–131 (1970).

315. Farron F. F., Lightholder J. R. Biochem. Biophys. Res. Commun., 83, 94-100 (1978).

116. Felsenfeld G. Nature, 271, 115–122 (1978).

117. Finch J. T., Lutter L. C., Rhodes D., Brown R. S., Ruston B., Levitt M., Klug A. Nature, 269, 29–36 (1977).

118. Fitzmaurice L. C., Baker R. F. Biochim. Biophys. Acta, 272, 510–517 (1972).

119. Flint S. J., Weintraub H. Cell, 12, 783–794 (1977).

120. Foe V. E., Wilkinson L. E., Laird C. D. Cell, 9, 131–146 (1976).

121. Fontana J. A., Lovenberg W. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 70, 755–758 (1973).

122. Freedlender E. F., Taichman L., Smithies O. Biochemistry, 16, 1802–1808 (1977).

123. Fukuei K., Yakura K., Tanifuji S. Biochim. Biophys. Acta, 518, 390–400

124. Gadski R. A., Chae C. B. Biochemistry, 17, 869–874 (1978).

125. Garel A., Axel R. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 73, 3966–3970 (1976)

126. Gaubatz J., Cutler R. G. Gerontology, 24, 179–207 (1978).

127. Gaubatz J., Prashad N., Cutler R. G. Biochim. Biophys. Acta, 418, 358–375 (1976).

128. Gautier F., Bunemann H., Grotjahn L. Europ. J. Biochem., 80, 175 (1977)

129. Germond J. E., Hirt B., Oudet P., Gross-Bellard M., Chambon P. Proc nat Acad. Sci. (USA), 72, 1843–1847 (1975).

130. Gershey E. L., Vidali G., Allfrey V. G. J. biol. Chem., 243, 5018–5022 (1968).

131. Gilmour R. S., Paul J. In: Chromosomal Proteins and their role in the Regulation of Gene Expression (G. S. Stein and L. J. Kleinsmith, Eds.), 19–33, Academic Press, New York and London (1975).

132. Goldberg N. D., O'Dea R. F., Haddox M. K. Adv. Cyclic Nucl. Res 3 155–223 (1973).

133. Goodman R. M., Schmidt E. C., Benjamin W. B. Cell Diff., 5, 233–246 (1977).

134. Goodwin G. H., Woodhead L., Johns E. W. FEBS Lett., 73, 85–88 (1977)

135. Gordon V. C., Knobler C. M., Olins D. E., Schumaker V. N. Proc. nat Acad Sci. (USA), 75, 660–663 (1978).

136. Gorovsky M. A., Pleger G. L., Keevert J. B., Johmann C. A. J. Cell Biol 57, 773–781 (1973).

137. Greengard P. Science, 199, 146–152 (1978).

138. Gronenborn B., Messing J. Nature, 272, 375–377 (1978).

139. Gross-Bellard M., Chambon P. Cell, 4, 281–300 (1975).

140. Gurley L. R., D'Anna J. A., Barham S. S., Deaven L. L., Tobey R. A. Eur. J. Biochem., 84, 1-15 (1978).

141. Gurley L. R., Hardin J. M. Arch. Biochem. Biophys., 130, 1–6 (1969).

142. Gurley L. R., Irvin J. L., Holbrook D. J. Biochem. Biophys. Res Commun., 14, 527–532 (1964).

143. Gurley L. R., Walters R. A., Tobey R. A. J. Cell Biol., 60, 356–364 (1974).

144. Gurley L. R., Walters R. A., Tobey R. A. J. biol Chem., 250, 3936–3944 (1975).

145. Guroff G., Brodsky M. J. Neurochem., 18, 2077–2084 (1971).

146. Hagopian H. K., Riggs M. G., Swartz L. A., Ingram V. M. Cell, 12, 855–860 (1977).

147. Hahn H. P. von. Gerontologia, 8, 123–131 (1963).

148. Hahn H. P. von. Gerontologia, 10, 174–182 (1964, 1965).

149. Hahn H. P. von, Fritz E. C. Gerontologia, 12, 237–250 (1966).

150. Hahn H. P. von. Expl. Gerontol., 5, 323–334 (1970).

151. Hamana K., Iwai K. J. Biochem., 83, 279–286 (1978).

152. Hamilton T. H., Widnell C. C., Tata J. R. J. biol. Chem., 243, 408–417 (1968).

153. Hancock R. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 2130–2134 (1978).

154. Hartman P. G., Chapman G. E., Moss T., Bradbury E. M. Eur. J. Biochem., 77, 45–51 (1977).

155. Hayaishi O. Trends Biochem. Sci., 1, 9-10 (1976).

156. Hemminki K., Bolund L. Cell Diff., 3, 347–359 (1977).

157. Hewish D. R., Burgoyne L. A. Biochem. Biophys. Res. Commun., 52, 504–510 (1973).

158. Hill B. T., Baserga R. Biochem. J., 141, 27–34 (1974).

159. Hnilica L. S. Experientia, 20, 13–14 (1964).

160. Hohmann P., Cole R. D. J. molec. Biol., 58, 533–540 (1971).

161. Hohmann P., Tobey R. A., Gurley L. R. Biochem. Biophys. Res. Commun., 63, 126–133 (1975).

162. Hohmann P., Tobey R. A., Gurley L. R. J. biol. Chem., 251, 3685–3692 (1976).

163. Holde K. E. Van, Sahashrabudhe C. G., Shaw B. R., Bruggen E. F. J. Van, Arnberg A. C. Biochem. Biophys. Res. Commun., 60, 1365–1370 (1974).

164. Honda B. M., Candido E. P. M., Dixon G. H. J. biol. Chem., 250, 8686–8689 (1975).

165. Honda B. M., Dixon G. H., Candido E. P. M. J. biol. Chem., 250, 6881–8685 (1975).

166. Hsiang M. W., Cole R. D. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 4852–4856 (1977).

167. Huang R. C., Bonner J. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 48, 1216–1222 (1962).

168. Huang P. C., Branes L. A., Mura C., Quagliarello V., Bohdan P. K. In: Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus (P. O. P. Ts'o, Ed.), Vol. 1, 105–126, North-Holland, Amsterdam (1977).

169. Iatrou L., Dixon E. M. Fed. Proc, 37, 2526–2533 (1978).

170. Iatrou K., Spira A. W., Dixon D. H. Devi. Biol., 64, 82–98 (1978).

171. Imai H., Shimayama M., Yamamoto S., Tanigawa Y., Ueda I. Biochem. Biophys. Res. Commun., 66, 856–862 (1975).

172. Jackson V., Shires A., Chalkley R., Granner D. K. J. biol. Chem., 250, 56–63 (1975).

173. Jansing R. L., Stein J. L., Stein G. S. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 173–177 (1977).

174. Javaherian K., Amini S. Biochim. Biophys. Acta, 478, 295–304 (1977).

175. Jeppesen P. G. N., Bankier A. T., Sanders L. Expl. Cell. Res., 115, 293–302 (1978).

176. Johns E. W. Biochem. J., 92, 55–59 (1964).

177. Johns E. W., Goodwin G. H., Hastings J. R. B., Walker J. M. In: Organisation and Expression of Eukaryotic Genome (E. M. Bradbury and K. Javaherian, Eds.), 3-19, Academic Press, London and New York (1977).

178. Johns E. W., Goodwin G. H., Walker J. M., Sanders C. Ciba Found Symp., 28, 95-112 (1975).

179. Johnson E. M., Allfrey V. G., Bradbury E. M., Mathews H. R. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 1116–1120 (1978).

180. Jungmann R. A., Kranias E. G. Int. J. Biochem., 8, 819–830 (1977).

181. Kanungo M. S., Koul O., Reddy K. R. Expl. Gerontol., 5, 261–269 (1970).

182. Kanungo M. S., Thakur M. K. Biochem. Biophys. Res Commun., 79, 1031–1036 (1977).

183. Kanungo M. S., Thakur M. K. J. Steroid Biochem., 11, 879–887 (1979).

184. Kanungo M. S., Thakur M. K. Biochem. Biophys. Res. Commun., 87, 266–271 (1979).

185. Kanungo M. S., Thakur M. K. Biochem. Biophys. Res. Commun., 86, 14–19 (1979).

186. Karn J., Johnson E. M., Vidali G., Allfrey V. G. J. biol. Chem., 249, 667–677 (1974).

187. Kedes L. H. Cell, 8, 321–331 (1976).

188. Kedes L. H., Gross P. R. Nature, 223, 1335–1339 (1969).

189. Kincade J. M., Jr., Cole R. D. J. biol. Chem., 241, 5790–5797 (1966).

190. Kincade J. M., Jr., Cole R. D. J. biol. Chem., 241, 5798–5805 (1966).

191. Kleinsmith L. J. J. Cell Physiol., 85, 459–475 (1975).

192. Kleinsmith L. J., Stein J., Stein G. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 73, 1174–1178 (1976).

193. Kleinsmith L. J., Heidema J., Carroll A. Nature, 226, 1025–1026 (1970).

194. Kleinsmith L. J., Stein G. S. Science, 194, 428–431 (1976).

195. Klevan L., Datta Gupta N., Hogan M., Crothers D. M. Biochemistry, 17, 4533–4540 (1978).

196. Knippers R., Otto B., Bohme R. Nucl. Acid Res., 5, 2113–2131 (1978).

197. KoostraA., Bailey G. S. Biochemistry, 17, 2504–2510 (1978).

198. Komberg R. D. Science, 184, 868–871 (1974).

199. Komberg R. D. Ann. Rev. Biochem., 46, 931–954 (1977).

200. Komberg R. D., Thomas J. O. Science, 184, 865–868 (1974).

201. Kostraba N. C., Loor R. M., Wang T. Y. Biochem. Biophys. Res. Commun., 79, 347–351 (1977).

202. Kostraba N. C., Montagna R. N., Wang T. Y. J. biol. Chem., 250, 1548–1555 (1975).

203. Kostraba N. C., Montagna R. N., Wang T. Y. Biochem. Biophys. Res. Commun., 72, 334–338 (1976).

204. Krebs E. G. Curr. Topics Cell Regulation, 5, 99-133 (1972).

205. Kunkel N. S., Hemminki K., Weinberg E. S. Biochemistry, 17, 2591–2598 (1978).

206. Kurochkin S. N., Trakht I. N., Severin E. S., Cole R. D. FEBS Lett, 84, 163–166 (1978).

207. Kurtz D. I., Russell A. R., Sinex F. M. Mech. Age. Dev., 3, 37–49 (1974)

208. Kurtz D., Sinex F. M. Biochim. Biophys. Acta, 145, 840–842 (1967).

209. Lake R. S. Nature (New Biol.), 242, 145–146 (1973).

210. Lake R. S., Salzman N. P. Biochemistry, 11, 4817–4826 (1972).

211. Lambropoulos H. L., Follow K. Biochem. Biophys. Res. Commun., 80, 773–780 (1978).

212. Lamy F., Lecocq R., Dumont J. E. Eur. J. Biochem., 73, 529–555 (1977)

213. Langan T. A. Science, 162, 579–580 (1968).

214. Langan T. A. J. biol. Chem., 244, 5763–6765 (1969).

215. Langan T. A. Ann. N. Y. Acad. Sci., 185, 166–180 (1971).

216. Langan T. A., Hohmann P. Fed. Proc, 33, 1597 (1974).

217. Laskey R. A., Honda B. M., Mills A. D., Finch J. T. Nature, 275, 416–420 (1978).

218. Lee H., Paik W. K. Biochim. Biophys. Acta, 277, 107–116 (1972).

219. Lee H., Paik W. K., Borun T. W. J. biol. Chem., 248, 4194–4199 (1973).

220. Leffak M., Grainger R., Weintraub H. Cell, 12, 837–845 (1977).

221. Leibovitch M. P., Tichonicky L., Kruh J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 81,623–629 (1978).

222. Le Stourgeon W. M., Rusch H. P. Science, 174, 1233–1235 (1971).

223. Letnansky K. FEBS Lett., 89, 93–97 (1978).

224. Levi V., Jacobson E. L., Jacobson M. K. FEBS. Lett., 88, 144–146 (1978).

225. Levy A., Jakob K. M. Cell, 14, 259–267 (1978).

226. Levy S., Childs G., Kedes L. Cell, 15, 151–162 (1978).

227. Levy-Wilson B., Gjerset R. A., McCarthy B. J. Biochim. Biophys. Acta, 475, 168–175 (1977).

228. Libby P. R. Biochem. Biophys. Res. Commun., 31, 59–65 (1968).

229. Liew C. V., Haslett G. W., Allfrey V. G. Nature, 226, 414–417 (1970).

230. Lifton R. P., Goldberg M. L., Karp R. W., Hogness D. S. Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol., 42, 1047–1052 (1978).

231. Limas C. J., Limas C. Nature, 271, 781–783 (1978).

232. Lipps H. J. Cell Dili., 4, 123–129 (1975).

233. Little J. B. Gerontology, 22, 28–55 (1976).

234. Liu A. Y.-C, Greengard P. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 73, 568–572 (1976).

235. Lough J., Bischoff R. Devi. Biol., 57, 330–344 (1977).

236. Louie A. J., Dixon G. H. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 69, 1975–1979 (1972).

237. Lue P. F., Gornall A. G., Liew C. C. Can. J. Biochem., 51, 1177–1194 (1973).

238. Luiter L. C. J. Molec. Biol., 124, 391–420 (1978).

239. Mainwaring W. I. P. Biochem. J., 110, 79–86 (1968).

240. Mann M. B., Smith H. O. Nucl. Acid. Res., 4, 4211 (1977).

241. Marushige K. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 73, 3937–3941 (1976).

242. Marushige Y., Marushige T. Biochim. Biophys. Acta, 518, 440–449 (1978).

243. Massie H. R., Baird M. B., Nicolosi R. J., Samis H. V. Arch. Biochem. Biophys., 153, 736–741 (1972).

244. Mathis D. J., Oudet P., Wasylyk B., Chambon P. Nucl. Acid Res., 5, 3523–3547 (1978).

245. Mauro E. D., Deone F., Pomponi M. Biochem. J., 174, 95-102 (1978).

246. McBroom M. J., Weiss A. K. J. Gerontol., 28, 143–151 (1973).

247. McCleary A. R., Nooden L. D., Kleinsmith L. J. J. biol. Chem., 253, 5199–5205 (1978).

248. Medvedev Zh. A., Medvedeva M. N., Huschtscha L. I. Gerontology, 23, 334–341 (1977).

249. Medvedev Zh. A., Medvedeva M. N., Robson L. Gerontology, 24, 286–292 (1978).

250. Melli M., Spinelli G., Arnold E. Cell, 12, 167–174 (1978).

251. Mirsky A. E., Pollister A. W. J. Gen. Physiol., 30, 117–148 (1946).

252. Mirzabekov A. D., Shick V. V., Betyavsky A. V., Bavykin S. G. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 4184–4188 (1978).

253. Mitchelson K., Chambes T. L., Bradbury E. M., Mathews H. R. FEBS Lett., 92, 339–342 (1978).

254. Miwa M., Tanaka M., Matsushima T., Sugimura T. J. biol. Chem., 249, 3475–3482 (1974).

255. Miyazaki K., Hagiwara H., Nagao Y., Matuo Y., Horio T. J. Biochem., 84, 135–143 (1978).

256. Moll G. W., Jr., Kaiser E. T. J. biol. Chem., 252, 3007–3011 (1977).

257. Morris G. E., Cooke A., Cole R. J. Expl. Cell Res., 74, 582–584 (1972).

258. Morris G. E., Lewis P. N. Eur. J. Biochem., 77, 471–477 (1977).

259. Morris G. E., Piper M., Cote R. Nature, 263, 76–77 (1976).

260. Moss B., Gersowitz A., Weber L., Baglioni C. Cell, 10, 113–120 (1977).

261. Moss T., Stephens R. M., Crane-Robinson L., Bradbury E. M. Nucl. Acid Res., 4, 2477–2485 (1977).

262. Murphy R. F., Wallace R. B., Bonner J. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 5903 5907 (1978).

263. Murray K. J. molec. Biol., 15, 409–419 (1966).

264. Murthy L. D., Pradhan D. E., Sreenivasan A. Biochim. Biophys. Acta, 199, 500–510 (1970).

265. Nakane M.t Ide T., Anzal K., Ohara S., Andoh T. J. Biochem., 84, 145–157 (1978).

266. Neelin J. M., Butler G. C. Can. J. Biochem, 39, 485–491 (1961).

267. Nelson D. A., Perry M., Sealy L., Chalkley R. Biochem. Biophys. Commun, 82, 1346–1353 (1978).

268. Nelson D. A., Perry M., Sealy L., Chalkley R. Biochem. Biophys. Res. Commun, 82, 1346–1353 (1978).

269. Nishizuka Y, Ueda K., Honjo T., Hayaishi O. J. biol. Chem, 243, 3765–3767 (1968).

270. Offerbacher S., Klein E. S. Biochem. Biophys. Res. Commun, 66, 375–382 (1975).

271. Okayama H., Ueda K., Hayaishi O. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 1111–1115 (1978).

272. Olins A. L, Olins D. E. Science, 183, 330–332 (1974).

273. Oliver D., Balhorn R., Granner D. R., Chalkley R. Biochemistry, 11, 3921–3925 (1972).

274. O'Meara A., Herrmann R. Biochim. Biophys. Acta, 269, 419–427 (1972).

275. Ord M. G., Stocken L. A. Biochem. J, 98, 888–897 (1966).

276. Ord M. G., Stocken L. A. Proc. FEBS Symp. 9th, 34, 113–125 (1975).

277. Ord M. G., Stocken L. A. Biochem. J, 161, 583–592 (1977).

278. Ord M. G., Stocken L. A. Biochem. J, 176, 615–618 (1978).

279. Otake H., Miwa M., Fujumura S., Sugimura T. J. Biochem, 65, 145–150 (1969).

280. Otero R. D., Felsenfeld G. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 5519–5523 (1977).

281. Pages M., Alonso C. Nucl. Acid. Res, 5, 549–562 (1978).

282. Palmiter R. D., Mulvihill E. R., McKnight G. S., Senear A. W. Cold Spring-Harbor Symp. Quant. Biol, 42, 639–648 (1978).

283. Paponov V. D., Gromov P. S., Sokolov N. A., Spitkovsky D. M., Tseitlin P. I. Biochem. Biophys. Res. Commun, 82, 674–679 (1978).

284. Park W., Jansing R., Stein J., Stein G. Biochemistry, 16, 3713–3721 (1977).

285. Paul J., Gilmour R. S. J. molec. Biol, 34, 305–316 (1968).

286. Perrella F. W., Lee M. A. Biochem. Biophys. Res. Commun, 82, 575–581 (1978).

287. Perry M., Nelson D., Moore M., Chalkley R. Biochim. Biophys. Acta, 561 517–525 (1979).

288. Phillips D. M. P. Biochem. J, 87, 258–263 (1963)

289. Pogo B. G. T., Allfrey V. G., Mirsky A. E. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 55, 805–812 (1966).

290. Pogo B. G. T., Pogo A. O., Allfrey V. G., Mirsky A. E. Proc. nat. Acad-Sci. (USA), 59, 1337–1344 (1968).

291. Prashad N., Cutler R. G. Biochim. Biophys. Acta, 418, 1-23 (1976).

292. Prentice D. A., Taylor S. E., Newmark M. Z., Kitos P. A. Biochem. Biophys. Res. Commun, 85, 541–550 (1978).

293. Prescott D. M. J. Cell. Biol., 31, 1–9 (1966).

294. Price G. B., Modak S. P., Makinodan T. Science, 171, 917–920 (1971).

295. Pumo D. E., Stein G. S., Kleinsmith L. J. Cell Diff., 5, 45–52 (1976).

296. Pyhtila M. J., Sherman F. G. Biochem. Biophys. Res. Commun., 31, 340–344 (1968).

297. Rabbani A., Goodwin G. H., Johns E. W. Biochem. J., 173, 497–505 (1978).

298. Rastl E., Swetly P. J. biol. Chem., 253, 4333–4340 (1978).

299. Rattle H. W. E., Langan T. A., Danby S. E., Bradbury E. M. Eur. J. Biochem., 81, 499–505 (1977).

300. Reeves R., Candido E. P. M. FEBS Lett., 91, 117–120 (1978).

301. Rem M., Nehls P., Hozier J. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 1879–1883 (1977).

302. Riggs M. G., Whittaker R. G., Neumann J. R., Ingram V. M. Nature, 268, 462–464 (1977).

303. Robbins E., Borun T. W. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 57, 409–416 (1967).

304. Roizes G. Nucl. Acid Res., 3, 2677 (1976).

305. Rovera G., Farber J., Baserga R. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 68, 1725–1729 (1971).

306. Rubin C. S., Rosen O. M. Ann. Rev. Biochem., 44, 831–887 (1975).

307. Ruderman J. V., Gross P. R. Devi. Biol., 36, 286–298 (1974).

308. Ruiz-Carrillo A., Wangh L. J., Allfrey V. G. Science, 190, 117–128 (1975).

309. Ruiz-Carrillo A., Wangh L. J., Littau V. C., Allfrey V. G. Arch. Biochem. Biophys., 174, 273–290 (1976).

310. Sadgopal A., Bonner J. Biochim. Biophys. Acta, 186, 349–357 (1969).

311. Samis H. V., Wulff V. J., Falzone J. A. Biochim. Biophys. Acta, 91, 223–232 (1964).

312. Schaffner W., Kunz G., Daetwyler H., Telford J., Smith H. O., Birnsteil M. L. Cell, 14, 655–671 (1978).

313. Scheer V. Cell, 13, 535–549 (1978).

314. Schmidt E. C., Goodman R. M. Differentiation, 6, 177–186 (1976).

315. Sealy L., Chalkley R. Cell, 14, 115–121 (1978).

316. Sealy L., Chalkley R. Nucl. Acid Res., 5, 1863–1876 (1978).

317. Seibert G., Ord M. G., Stocken L. A. Biochem. J., 122, 721–725 (1971).

317a. Shainberg A., Yagil G., Yaffe D. Devi. Biol., 25, 1-29 (1971).

318. Shaw P. A., Sahasrabudhe C. G., Hodo H. G., Saunders G. F. Nucl. Acid Res., 5, 2999–3012 (1978).

319. Shea M., Kleinsmith L. J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 50, 473–477 (1973).

320. Shepherd G. R., Noland B. J., Hardin J. M., Byvoet P. Biochemistry of Geno Expression in Higher Organisms, 164–176, Australia and New Zealand Book Company, Sydney (1973).

321. Shoemaker C. B., Chalkley R. J. biol. Chem., 253, 5802–5807 (1978).

322. Simon D., Grunert F., Acken U., Doring H. P., Kroger H. Nucl. Acid Res, 5, 2153 (1978).

323. Singer J., Roberts-Ems J., Riggs A. D. Science, 203, 1019–1021 (1979).

324. Simpson R. T. Cell, 13, 691–699 (1978).

325. Spelsberg T. C., Hnilica L. S. Biochem. J., 120, 435–437 (1970).

326. Spiker S., Mardian J. K. W., Isenberg I. Biochem. Biophys. Res. Commun., 82, 129–135 (1978).

327. Söllner-Webb B., Camerini-Otero R. D., Felsenfeld G. Cell, 9, 179–193 (1976).

328. Söllner-Webb B., Felsenfeld G. Biochemistry, 14, 2915–2920 (1975).

329. Söllner-Webb B., Mechior W., Felsenfeld G. Cell, 14, 611–627 (1978).

330. Stedman E., Stedman E. Nature, 152, 556–557 (1943).

331. Stein G. S., Park W., Thrall C, Mans R., Stein J. Nature, 257, 764–767 (1975)

332. Stein G. S., Spelsberg T. C., Kleinsmith L. J. Science, 183, 817–824 (1974).

333. Sterner R., Vidali G., Heinnikson R. L., Allfrey V. G. J. biol. Chem., 253, 7601–7604 (1978).

334. Sugimura T. Prog. Nuc Acid Res. Mol. Biol., 13, 127–151 (1973).

335. Sung M. T., Freedlender E. F. Biochemistry, 17, 1884–1890 (1978).

336. Sung M. T., Harford J., Bundman M., Vidalakas G. Biochemistry, 16, 279–285 (1977).

337. Sussman J. L., Trifonov E. N. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 103–107 (1978).

338. Takaku F., Nakao K., Ono T., Terayama H. Biochim. Biophys. Acta, 195, 396–400 (1969).

339. Tanaka M., Hayashi K., Sakura H., Miwia M., Matushima T., Sugimura T. Nucl. Acid Res., 5, 3183–3194 (1978).

340. Tanigawa Y., Kawamura M., Shimoyama M. Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 406–412 (1977).

341. Tanigawa Y., Kitamura A., Kawamura M., Shimoyama M. Eur. J. Biochem., 92, 261–269 (1978).

342. Tanphaichitr N., Chalkley R. Biochemistry, 15, 1610–1614 (1976).

343. Tarnowka M. A., Baglioni C., Basilico C. Cell, 15, 163–171 (1978).

344. Tata J. R., Baker B. J. molec. Biol., 118, 249–272 (1978).

345. Tatchell K., Holde K. E. Van. Biochemistry, 16, 5295–5303 (1976).

346. Teng C., Hamilton T. H. Biochem. Biophys. Res. Commun., 40, 1231–1238 (1970).

347. Teng C. S., Teng C. T., Allfrey V. G. J. biol. Chem., 246, 3597–3609 (1971).

348. ThakurM. K. Biochemistry of Aging: Modifications of chromosomal proteins of the brain of the rat, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University (1978).

349. Thakur M. K., Das R., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 81, 828–831 (1978).

350. Thomas G., Lange H. W., Hempel K. Eur. J. Biochem., 51, 609–615 (1975).

351. Thompson J. A., Stein J. L., Kleinsmith L. J., Stein G. S. Science, 194, 428–430 (1976).

352. Tidwell T., Allfrey V. G., Mirsky A. E. J. biol. Chem., 243, 707–715 (1968).

353. Tsanev R., Russev G. Europ. J. Biochem., 43, 257–263 (1974).

354. Ts'o P. O. P. (Ed.) Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus, Vols. I and II, North-Holland, Amsterdam (1977).

355. Turkington R. W. Biochim. Biophys. Acta, 213, 478–483 (1970).

356. Ueda K., Omachi A., Kawachi M., Hayaishi O. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 72,205–209 (1975).

357. Uy R., Wold F. Science, 198, 890–896 (1977).

358. Yanyushin B. F., Nemirovsky L. E., Klimenko V. V., Vasiliev V. K., Belozersky A. N. Gerontologia, 19, 138–152 (1973).

359. Vidali G., Boffa L. C, Bradbury E. M., Allfrey V. G. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 2239–2243 (1978).

360. Vincent R. A., Huang P. C. Expl. Cell. Res., 102, 31–45 (1976).

361. Walker J. M., Hastings J. R. B., Johns E. W. Nature, 271, 281–282 (1978).

362. Wallace R. B., Sargent T. D., Murphy R. F., Bonner J. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 3244–3248 (1977).

363. Walwork J. C., Quick D. P., Duerre J. A. J. biol. Chem., 252, 5977–5980 (1977).

364. Wang T. Y. Expl. Cell Res., 61, 455–460 (1970).

365. Watson G., Langan T. A. Fed. Proc, 32, 588 (1973).

366. Weintraub H. Nature, 240, 449–453 (1972).

367. Weintraub H., Groudine M. Science, 193, 848–856 (1976).

368. Weintraub H., Lente F. Van. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 71, 4249–4253 (1974).

369. Weintraub H., Worcel A., Alberts B. Cell, 9, 409–417 (1976).

370. Welch S. L., Cole R. D. J. biol. Chem., 254, 662–665 (1979).

371. Whitlock J. P., Stein A. J. biol. Chem., 253, 3857–3861 (1978).

372. Wilhelm F., Wilhelm M. L., Erard M., Daune M. P. Nucl. Acid. Res., 5, 505–521 (1978).

373. Wilson M. C., Melli M. J. molec. Biol., 110, 611–535 (1977).

374. Wong N. C. W., Poirier G. G., Dixon G. H. Eur. J. Biochem., 77, 11–21 (1977).

375. Worcel A., Han S., Wong M. L. Cell, 15, 969–977 (1978).

376. Yabuki H., Iwai K. J. Biochem., 82, 679–686 (1977).

377. Yaffe D., Fuchs S. Devi. Biol., 15, 33–50 (1967).

378. Yamaizumi M., Uchida T., Okada Y., Furusawa M., Mitsui H. Nature, 273, 782–784 (1978).

379. Yarbo J. W. Biochim. Biophys. Acta, 145, 531–534 (1967).

380. Yoshihara K., Hashida T., Tanaka Y., Ohgushi H., Yoshihara H., Kamiya T. J. biol. Chem., 253, 6459–6466 (1978).

381. Yoshihara K., Tanigawa Y., Koide S. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 59, 658–665 (1974).

382. Yu S. S., Li H. J., Goodwin G. H., Johns E. W. Eur. J. Biochem., 76, 461–468 (1977).

383. Yu S. S., Li H. J., Goodwin G. H., Johns E. W. Eur. J. Biochem., 78, 497–502 (1977).

384. Zhelabov S. M., Berdyshev G. D. Expl. Gerontol., 7, 313–320 (1972).

385. Zlatanova J., Swetly P. Nature, 276, 276–277 (1978).

Глава 3. Изменение ферментов в процессе старения

Введение

Ферментами называются белки, катализирующие различные реакции в организме. Они состоят из одной или нескольких полипептидных цепей, или субъединиц. Каждая субъединица представляет собой специфическую последовательность аминокислот, которая кодируется соответствующим геном. Обычно субъединица содержит более 100 аминокислот. Каталитический, или активный, центр фермента состоит из нескольких аминокислотных остатков, расположенных в различных местах линейной последовательности, или первичной структуры, но сближенных друг с другом в результате свертывания цепи. Специфическая последовательность аминокислот необходима не только для соответствующей укладки цепи, но также для обеспечения каталитической активности фермента. Перестройка последовательности аминокислот вызывает изменение активности фермента.

Все биологические реакции в организме катализируются ферментами, т. е. ферменты необходимы для осуществления различных функций организма. Следовательно, изменения их свойств в процессе старения могут приводить к изменениям функциональных способностей организма. Накоплено значительное количество данных, показывающих, что после полового созревания содержание одних ферментов снижается, а других — повышается. Вместе с тем есть ферменты, содержание которых не меняется. Изменения количества различных ферментов наблюдаются также на ранних стадиях жизни, таких, как дифференцировка и развитие. Поскольку ферменты ответственны за специфические функции организма, начало, продолжительность и окончание различных периодов, таких, как дифференцировка, развитие и половое созревание, могут зависеть от появления, исчезновения или изменений содержания специфических ферментов или их изоферментов. Каждый фермент или изофермент кодируется обычно одним или двумя генами. Следовательно, изучение различных аспектов функционирования ферментов — их содержания, строения изоферментов, индукции и молекулярных свойств, может помочь в выяснении механизма старения на генетическом уровне.

Изменения в содержании ферментов

В некоторых работах сравнивали содержание или активность ферментов у животных среднего возраста и у старых животных. Однако анализ этих данных затруднен по следующим причинам. 1) Разные авторы использовали различные методики исследования, которые дают разные значения измеряемых параметров для одних и тех же ферментов. 2) Ферменты в основном исследовались при насыщающих концентрациях субстрата, т. е. в условиях, сильно отличающихся от нормальных физиологических. 3) Некоторым ферментам свойственны циркадные ритмы, следовательно, при измерении их активности в разное время суток должны получать разные результаты. 4) Разные авторы использовали разные единицы для измерения содержания фермента: на 1 г сырого веса, на 1 г сухого веса, на 1 мг белка или на 1 мг ДНК. Поскольку уровень большинства этих факторов, кроме ДНК, с возрастом меняется, сравнение активности ферментов при двух различных возрастах провести очень трудно. Нельзя сделать правильные заключения, если активность одного фермента в метаболическом пути выражена в Ед. на 1 мг белка, а других ферментов — на 1 г сухого веса. 5) Разные авторы считали старческим разный возраст животных, например некоторые рассматривали 60-не-дельных (15-16-месячных) крыс как старых, на самом же деле это животные в стадии поздней зрелости. Другие считали старыми 100-недельных крыс. 6) Из одинакового хронологического возраста двух популяций, содержащихся на разном рационе и в разных условиях окружающей среды, вовсе не следует, что особи этих популяций имеют одинаковый физиологический статус. Если не контролируются все параметры эксперимента, данные двух разных лабораторий сравнивать нельзя. 7) Результаты, полученные для одного пола, иногда нельзя сравнивать с результатами, полученными для другого пола. 8) Данные для одной линии животных трудно сопоставлять с данными для другой. 9) Для сравнительных исследований в основном использовали печень млекопитающих. В любой момент приблизительно 0,01 % клеток печени находится в процессе деления, т. е. печень содержит гетерогенную смесь делящихся и неделящихся клеток. Следовательно, данные для печени несравнимы с данными для мозга и скелетных мышц, в которых клетки не делятся. 10) Выбор ферментов для изучения, по-видимому, определяется имеющимися средствами.

По перечисленным выше причинам в настоящее время нет сопоставимых данных для всех ферментов хотя бы одного метаболического пути в каком-либо организме в зависимости от его возраста. У нас нет также достаточной информации о ключевых регуляторных ферментах различных метаболических путей, уровень которых определяет скорость процессов данного метаболического пути. Регуляция и содержание таких ферментов при различных физиологических состояниях и разных возрастах могут иметь гораздо большее значение, чем регуляция и содержание конститутивных ферментов того же пути, имеющихся обычно в избытке. Например, изучение активности глюкокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы, а также пируваткарбоксилазы, фруктозо-бисфосфатазы и глюкозо-6-фосфатазы, которые являются ключевыми регуляторными ферментами гликолиза и глюконеогенеза соответственно, могло бы иметь большое значение для понимания влияния старения на метаболизм глюкозы.

Появилось несколько обзоров, посвященных возрастным изменениям активности ферментов, в которых она выражена в единицах (Ед.) на 1 сырого веса, на 1 г сухого веса, на 1 мг белка (удельная активность) или на 1 мг ДНК [32, 34, 52, 112]. Для того чтобы собрать воедино и сопоставить данные по активности ферментов для разных животных, были использованы различные подходы. Те ферменты, активность которых была выражена в Ед.·мг-1 белка или Ед.·мг-1 ДНК, были подобраны в соответствии с их классом на основании номенклатуры ферментов с целью выяснить, не проявляются ли специфические изменения для каждого класса. Ферменты были также сгруппированы в соответствии с их локализацией в клетке. Старыми считались крысы старше 80 нед и мыши старше 70 нед, так как в этом возрасте самки этих видов теряют способность к воспроизведению потомства.

Табл. 3.1 показывает, что даже в пределах одного класса активность некоторых ферментов, выраженная в Ед.·мг-1 белка и Ед.·мг-1 ДНК, у старых животных ниже, чем у животных среднего возраста, тогда как активность других — выше. Вместе с тем есть ферменты, для которых изменений не наблюдается. Таким образом, в пределах одного класса ферментов для старческого возраста единой закономерности не обнаружено. Более того, с возрастом содержание некоторых ферментов повышается в одних тканях и понижается в других. Однако количество изученных ферментов еще весьма мало для того, чтобы делать какие-либо обобщения. Из полученных данных следует, что после окончания репродуктивного периода активность ферментов, ответственных за окисление, снижается в постмитотических тканях — в сердце, скелетных мышцах и мозгу, тогда как для ферментов, расположенных в различных частях клеток, никакой закономерности в изменении активности не обнаружено.

Таблица 3.1. Активность ферментов, выделенных из различных органов и органелл млекопитающих, как функция возраста

1) Сравнение проводили между двумя возрастами, приведенными в столбце "Возраст".

2) Полушария головного мозга.

3) Мозжечок.

В табл. 3.2 показаны возрастные изменения содержания ферментов различных классов в аорте человека и в некоторых других органах. Хотя приведенные данные в большинстве своем выражены в Ед.·г-1 сырого веса, они представляют определенный интерес, так как относятся к человеку. В основном с возрастом снижается содержание оксидоредуктаз, тогда как для других классов ферментов какой-либо закономерности в изменении активности не наблюдается.

Таблица 3.2. Изменение ферментов в организме человека в процессе старения

Вместе с тем у беспозвоночных обнаружены определенные возрастные изменения активности ферментов. Активность некоторых оксидоредуктаз понижается, тогда как других повышается, а третьих не изменяется. В то же время активность всех до сих пор изученных трансфераз понижается, а активность большинства гидролаз повышается. Исследования на беспозвоночных имеют тот большой недостаток, что измерения проводились на целом организме животных. Вряд ли можно делать определенные заключения, если опыты проводятся не на отдельных органах.

Таблица 3.3. Изменение ферментов у беспозвоночных

Хотя содержание некоторых ферментов было изучено как функция возраста, полученные данные мало что дали для выяснения механизма старения. Ясно, однако, что изменения активности ферментов в старости должны оказывать влияние на функциональные возможности организма.

Изменения в наборе изоферментов

Появление различных типов гемоглобинов в течение периода развития человека является примером изменения молекулярных форм одного и того же белка, коррелирующего с функциональными изменениями [116]. Гемоглобин является тетрамерным белком, состоящим из четырех глобиновых субъединиц, или полипептидных цепей. Гемоглобин 1-2-месячного зародыша относится к α2ε2-типу. В течение последующего периода беременности (от 2 до 10 мес) он заменяется на гемоглобин типа α2γ2 (HbF). Гемоглобин новорожденного относится к типу α2β2 (HbA) и сохраняется до конца жизни (рис. 3.1). Субъединицы α, ε, γ и β кодируются отдельными генами. Следовательно, последовательное изменение типа гемоглобина происходит благодаря активации одних генов и одновременной репрессии других. В этом аспекте интересно следующее: а) α-ген активен в течение всего периода жизни, тогда как ε-, γ- и β-гены активируются один за другим в указанной последовательности; б) когда активируется γ-ген, репрессируется ε-ген; когда активируется β-ген, репрессируется γ-ген; в) длительность активного состояния генов различна: α-ген активен в течение всей жизни, в то время как ε-ген активен только 1 мес, γ-ген — 8 мес, а β-ген — после рождения и в последующий период. Гемоглобин переносит в ткани кислород. Способность к связыванию кислорода у гемоглобинов разных типов различна. Например, зародышевый гемоглобин HbF имеет большую способность к связыванию кислорода, чем гемоглобин взрослого организма HbA. Известно также, что содержание кислорода в материнской крови, снабжающей зародыш, ниже, чем в легких. Следовательно, гемоглобин с более высокой способностью к связыванию кислорода предназначен для преимущественного развития зародыша. Неизвестно, играет ли роль уровень кислорода в материнской крови в экспрессии различных генов глобина.

Рис. 3.1. Синтез цепей гемоглобина у плода человека [116]

Так же как α2ε2, α2γ2, α2β2 являются различными молекулярными формами гемоглобина, изоферменты — это различные молекулярные формы одного и того же фермента. Изоферменты характерны для ферментов, состоящих из двух или более субъединиц. Досконально исследованным в этом отношении ферментом является лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализирующая обратимое превращение пирувата в лактат. В различных тканях крысы имеются пять изоферментов ЛДГ [110]. Они состоят из субъединиц двух типов, Н и М, которые соединяются в различных соотношениях и дают пять типов активных изоферментов: H4, Н3М1, Н2M2, Н1М3 и M4. Н- и М-субъединицы различаются по аминокислотной последовательности и кодируются двумя разными генами, что показано путем генетических исследований оленьей мыши [99]. Маркет и Мёллер [78] впервые показали, что тип изофермента ЛДГ не только специфичен относительно вида ткани, он изменяется также в одной и той же ткани в процессе развития (рис. 3.2). Было высказано предположение, что тип изофермента в ткани отражает степень дифференцировки ее клеток. На ранней зародышевой стадии животных в тканях преобладают типы М4 и H1М3, но в процессе развития наблюдается переход к изоферментам Н3М1 и Н4. Эта постепенная смена изоферментов указывает на переход к большей активности гена Н-субъединицы или к меньшей активности гена М-субъединицы.

Рис. 3.2. Электрофореграмма в крахмальном геле ЛДГ из тканей человека в период развития. Ткани взяты у 14-недельного эмбриона [75]

Следует отметить также, что Н4- и Н3М1-изоферменты присутствуют преимущественно в аэробных тканях, таких, как сердце, мозг и кора надпочечников, тогда как М4 и H1М3-изоферменты присутствуют преимущественно в анаэробных тканях, таких, как скелетные мышцы и печень [19, 79]. Эмбрион млекопитающего, растущий в анаэробном окружении, содержит большие количества М4- и Н1М3-изоферментов; с развитием эмбриона происходит переход к Н4- и Н3М1-рформам. Эмбрион птенца растет в аэробном окружении, и он содержит больше Н4 и Н3М1-форм. В процессе его развития происходит переход к М4- и Н1М3-изоферментам. Эти наблюдения подтверждают предположение о том, что соотношение изоферментов в тканях, по крайней мере частично, обусловлено давлением кислорода. Экспериментально на культурах тканей показано, что в анаэробных условиях клетки синтезируют больше М4-формы ЛДГ [41].

В свете вышесказанного существенны данные лаборатории Канунго по изменению соотношения изоферментов в тканях крысы в зависимости от возраста [55, 100], показывающие, что содержание М4-ЛДГ в сердце 96-недельной крысы значительно ниже, чем у 30-недельной (рис. 3.3). В скелетных мышцах (рис. 3.4) и в мозгу (рис. 3.5) содержание М4-ЛДГ также понижается. Относительное содержание Н4-ЛДГ у старых животных, наоборот, повышается. Эта смена форм изоферментов может иметь большое физиологическое значение для старого животного, поскольку она может вызвать изменения в функционировании органов.

Рис. 3.3. Активность ЛДГ, выделенной из сердца крысы, в зависимости от возраста [100].

 I — М-ЛДГ; II — Н-ЛДГ; III — (Н+М) — ЛДГ

Рис. 3.4. Активность ЛДГ, выделенной из скелетных мышц, в зависимости от возраста [100].

I — М-ЛДГ; II — Н-ЛДГ; III — (Н+М) — ЛДГ

Рис. 3.5. Активность ЛДГ, выделенной из мозга крысы, в зависимости от возраста [100].

I — М-ЛДГ; II — Н-ЛДГ; III — (Н+М) — ЛДГ

Известно, что М4-ЛДГ катализирует превращение пирувата в лактат лучше, чем Н4-ЛДГ [26]. Следовательно, для тканей в анаэробных условиях, где источник кислорода отсутствует или не соответствует потребностям, большое количество М4-ЛДГ является преимуществом. Благодаря этому ферменту ткань способна производить энергию путем анаэробного гликолиза, превращая пируват в лактат. Уменьшение относительного содержания М4-ЛДГ, происходящее в старости, может снижать способность ткани приспосабливаться к анаэробным условиям. Следовательно, вероятность повреждения ткани в результате недостатка энергии в старости должна быть больше. Это хорошо коррелирует с более частыми случаями сердечной недостаточности у людей старческого возраста. Переход к ингибированию синтеза М-субъединиц в этих тканях в старческом возрасте может сделать ткани более аэробными и все более зависящими от цикла Кребса. Если бы переход к понижению относительного содержания М4- и М3Н1-форм после достижения зрелости мог быть прекращен, то энергетические соотношения в организме могли бы поддерживаться такими же, как в репродуктивном периоде. Было показано, что 17β-эстрадиол в матке незрелых крыс и кроликов усиливает преимущественно синтез М-субъединиц, в то время как он не влияет на синтез Н-субъединиц [40]. Повышение уровня М-субъединиц в таких тканях, как сердце и мозг, может быть полезным для старых животных.

Пируваткиназа (РК) катализирует превращение фосфоенолпирувата в пируват. Этот фермент имеет четыре изофермента: РК-1, 2, 3 и 4. В скелетных мышцах крысы в момент рождения изофермент РК-4 является доминирующей формой, но примерно на 14-й день он исчезает и заменяется изоферментом РК-3, который сохраняется до 52 нед [85]. Такие же изменения наблюдаются в сердечной мышце. Эти исследования не проводились на более старых животных, однако ясно, что, как и в случае изоферментов ЛДГ, изоферменты РК последовательно сменяют друг друга до позднего периода зрелости. У РК-3 Км для фосфоенолпирувата ниже (0,75·10-4 М), чем у РК-4 (4·10-4 М) [49]. Переход к изоферменту РК-3 в процессе развития, возможно, происходит из-за постепенного перехода ткани к аэробным условиям. В аэробных условиях окисление пировиноградной кислоты в тканях приобретает большее значение. Таким образом, переход к РК-3 коррелирует с переходом к Н4-ЛДГ, причем и в том и в другом случае по окончании репродуктивного периода ткань становится более аэробной и более зависящей от цикла Кребса.

Креатинкиназа катализирует синтез креатинфосфата из креатина и АТР. Она является димером и имеет три изофермента: ВВ, MB и ММ [108]. На начальной стадии роста зародыша в его скелетных мышцах, сердце и мозге присутствует только изофермент ВВ. Этот изофермент в скелетных мышцах замещается в процессе развития последовательно на MB и затем на ММ. В сердце происходит переход от ВВ-типа к типам MB и ММ, в то время как в мозгу перехода от ВВ-типа не наблюдается [28]. Таким образом, смена изоферментов является тканеспецифичным процессом и зависит от возраста.

Аденилаткиназа — еще один фермент, участвующий в переносе энергии. Она катализует превращение AMP и ADP в присутствии АТР и имеет три изофермента — I, II и III. Печень содержит только изоферменты II и III в соотношении, изменяющемся в ходе развития. Активность изофермента II в зародыше составляет только 2 Ед., а изофермента III — 20 Ед. Через две недели после рождения она повышается до 25 и 118 Ед. соответственно. Таким образом, наблюдается количественное изменение содержания двух изоферментов [31].

Другая интересная форма изменения наблюдается для субъединиц фермента альдолазы в скелетных мышцах кролика. Альдолаза — это тетрамерный фермент, состоящий из субъединиц двух типов — α и β; ее молекулярная структура α2β2. Аминокислотный анализ фингерпринтов двух субъединиц после расщепления бромцианом показывает, что обе субъединицы почти идентичны; β-цепь отличается от α-цепи лишь несколькими модифицированными аминокислотами в области COOH-конца. По-видимому, обе субъединицы кодируются одним геном, но β-цепь образуется в результате модификации после трансляции. На ранних стадиях развития, в течение примерно двух месяцев после рождения, преобладает α-цепь. Однако по прошествии третьего месяца содержание обеих цепей становится одинаковым [72]. Причина повышения содержания β-субъединицы на определенной стадии развития неизвестна, но, очевидно, это повышение обусловлено физиологическими потребностями, возникающими на этой стадии.

Происходят ли такая последовательная активация и репрессия генов и последовательные изменения в формах изоферментов только на ранней стадии жизненного периода или они распространяются также на старческий возраст? Некоторые исследования показывают, что подобные изменения происходят не только в раннем периоде, но и на протяжении всей жизни. Формы изоферментов некоторых ферментов как функция возраста были исследованы на Drosophila. Электрофорез в крахмальном геле гексозофосфат-изомеразы мужских и женских особей D. melanogaster показал, что из пяти изоферментов относительное содержание трех, медленно движущихся, в старости (67 дней) значительно выше. У женских особей два быстро движущихся изофермента, имеющиеся в молодости, в старости исчезают [45]. Таким образом, количество изоферментов зависит также от пола.

Содержание изоферментов эстеразы Drosophila также меняется с возрастом. Три медленно движущихся изофермента, отсутствующие в молодом возрасте, появляются в старости (49 дней) [45]. Из пяти изоферментов алкогольдегидрогеназы (АДГ) АДГ3 и АДГ5 присутствуют в течение всего периода зрелости, в то время как АДГ2 — только в первые 12 дней после вылета [27]. Возможно, что АДГ2 специфически необходима на ранней стадии развития. Все описанные здесь изменения являются суммарными для изоферментов, содержащихся во всех органах Drosophila. Поскольку в разных органах могут происходить различные изменения в какой-либо период жизненного цикла, из этих исследований нельзя сделать каких-либо общих заключений. Трудности изучения изоферментов в отдельных органах такого маленького организма, как Drosophila, очевидны, но факт возникновения или исчезновения определенных изоферментов в старости ясно говорит о репрессии и активации в этом возрасте определенных генов в одном или нескольких органах. Не исключено, что подобные изменения влияют на физиологическое состояние организма в старческом возрасте. В отличие от исследований форм изоферментов эстеразы на Drosophila, изоферменты эстеразы у пятидневного и пятимесячного таракана, Periplaneta americana, изучали в грудной мышце и мышцах конечностей. При разделении в геле были обнаружены восемь полос. В данном случае не нашли никаких различий в формах изоферментов ни как функции возраста, ни как функции пола. Не обнаружено также количественных различий в формах изоферментов в гемолимфе.

В исследованиях цитоплазматической аланинаминотрансферазы (цААТ) из печени крысы четко показано, что явление последовательной смены форм изоферментов распространяется и на старческий возраст [56, 87]. цААТ является димером, состоящим из субъединиц двух типов — А и В. Существуют два активных изофермента: цААТ-А и цААТ-В. Электрофорез очищенной цААТ из печени 5-, 52- и 100-недельных самок крыс в полиакриламидном геле показывает, что печень незрелых крыс содержит только цААТ-А, а старых — только цААТ-В. В печени зрелых крыс присутствуют оба изофермента, но уровень цААТ-А ниже (рис. 3.6). Две субъединицы, А и В, детерминируются двумя отдельными генами [24]. Очевидно, последовательное появление и исчезновение двух изоферментов цААТ на протяжении жизни указывает на последовательное активирование и репрессию генов, ответственных за их синтез. Какие факторы определяют активность этих генов — неизвестно, но возможно, что, как и в случае гемоглобина, активируют или репрессируют гены эндогенные факторы, возникающие в различные периоды жизни, и это приводит к появлению или исчезновению соответствующих полипептидных цепей.

Рис. 3.6. Электрофорез кристаллической растворимой аланинаминотрансферазы незрелых (5 нед), среднего возраста (52 нед) и старых (100 нед) крыс в 7,5 %-ном полиакриламидном геле (0,082 М трис-боратный буфер, рН 8,9). В каждом случае наносили 50 мг белка.

А — аланинаминотрансфераза А; В — аланинаминотрансфераза В [56]

Несмотря на то что к настоящему моменту накоплено еще мало информации, очевидно, исследования изоферментов имеют большое значение для понимания возрастных изменений, происходящих на генетическом уровне. Изоферменты различаются по Км для определенного субстрата, и тонкий контроль метаболических механизмов может осуществляться благодаря изменению соотношения изоферментов. В результате происходящих в различные периоды жизни изменений эндогенных и экзогенных факторов путем модуляции активности соответствующих генов может меняться их относительное содержание. Это в свою очередь может влиять на скорости метаболических реакций и, следовательно, на функциональные возможности организма.

Индукция ферментов

Как было показано выше, с возрастом меняется не только активность ферментов — в определенные периоды жизни меняется также набор изоферментов. Отсюда возникают следующие вопросы:

1) Являются ли эти изменения необратимыми?

2) Возможно ли эти изменения направить вспять и можем ли мы регулировать их уровни в различные периоды жизни?

3) Какие факторы ответственны за эти изменения?

4) Какое значение эти изменения имеют для различных функций организма и для старения?

Получен ряд данных, позволяющих ответить на часть этих вопросов. Известно, что вторичные клетки флоэмы моркови, культивируемые in vitro, дают начало целому растению [107]. Следовательно, высокодифференцированные клетки флоэмы подвергаются дополнительной дифференциации, давая начало клеткам новых типов. На животных клетках подобные эксперименты пока не проводились. Митохондриальная малатдегидрогеназа (мМДГ) индуцируется кортизоном в печени молодых крыс, у которых удален надпочечник, и не индуцируется у старых [53]. Однако, если печень старой крысы регенерирует в результате гепатэктомии, то кортизон вызывает индукцию мМДГ. Таким образом, в этом случае способность к индукции восстанавливается и печень старой крысы функционирует так же, как печень молодой. Из данных экспериментов следует, что изменения макромолекул, происходящие при старении, не являются необратимыми. Содержание ферментов, понизившееся в старости, может быть увеличено путем индукции, и повреждения таким образом могут быть устранены.

Известно, что индукция, или повышение содержания ферментов, вызывается несколькими индукторами, или эффекторами. Индукция является специфическим ответом на специфический стимул, или индуктор, которым может быть субстрат, гормон, метаболит или даже экзогенный фактор — например температура, т. е. индукция — это адаптивный процесс. Как известно, адаптивность организма к условиям окружающей среды в старости снижается. Поэтому представляется интересным исследовать изменения адаптивности или индуцибельности ферментов с возрастом. Поскольку каждый фермент кодируется специфическим геном, подобные исследования могут помочь в выяснении таких функций специфических генов, как транскрипция специфических мРНК и регуляция этой транскрипции. Проводя их, можно также решить вопрос о том, происходят или не происходят изменения в экспрессии генов в старости.

В работах по индукции синтеза ферментов в тканях крысы путем введения различных гормонов было показано, что при одинаковых условиях эксперимента индукция у старых крыс в общем ниже, чем у животных в зрелом возрасте. Такие результаты были получены для глюкозо-6-фосфатазы и фруктозобисфосфат-альдолазы [101], фосфофруктокиназы [102, 103] и гексозофосфат-изомеразы [103], пируваткиназы [21], малатдегидрогеназы [53] и ацетилхолинэстеразы [81]. Для нескольких ферментов в зрелом возрасте и в старости получены одинаковые значения индукции — это триптофанпирролаза [42], аланинаминотрансфераза (ААТ) [87] и тирозинаминотрансфераза (ТАТ) [91], а индукция аргиназы [90] у старых животных оказалась выше (табл. 3.4), чем у животных в среднем возрасте.

Таблица 3.4. Индукция ферментов

Обозначения в Таблице: ↓ уменьшение; ↑ увеличение; "-" нет эффекта; Н — норма; К — кортизон; ГК — гидрокортизон; а — удаление надпочечника; б — удаление семенников; в — удаление яичников; Э50-Э100 — введение эстрадиола в количестве 50 и 100 мг·г-1 веса тела; Т50 и Т100 — введение тестостерона в количестве 50 и 100 мг·г-1 веса тела; П — полушария головного мозга; М — мозжечок.

Некоторые ферменты, например глюкокиназа и тирозинаминотрансфераза из печени мыши, индуцируются при голодании [2]. Было показано также, что тирозинаминотрансфераза печени индуцируется при низкой температуре [33]. В этих исследованиях установлено, что индукция у старых и молодых животных одинакова, но у первых время, необходимое для индукции, больше (табл. 3.4).

В общем, индукция оксидоредуктаз в старости понижается, а трансфераз — повышается или не изменяется. Индукция гидролаз и лиаз печени млекопитающих в старческом возрасте понижается, так же как и индукция трансфераз и гидролаз мозга. Однако пока число исследованных ферментов невелико, нельзя с уверенностью сделать заключение о закономерностях индукции определенных ферментов.

В приведенных исследованиях было показано также, что индукция одного и того же фермента по-разному меняется в разных органах. Например, индукция пируваткиназы в сердце старой крысы выше, чем у животного в среднем возрасте, в то время как в мозгу старой крысы она ниже по сравнению с животным в среднем возрасте [21–23].

Индукция многих ферментов в старческом возрасте уменьшается, и поэтому ослабевает адаптивность организма или его способность к ответу на соответствующий стимул. Эти ответы на основании времени, затрачиваемого на индукцию, и величины индукции (рис. 3.7) подразделяют на четыре главных типа [5]. У типа 1 лаг-период индукции в старости больше, но ее величина не меняется, если индуктор применяется в течение достаточного времени. Примерами этого типа ферментов являются глюкокиназа [1] (рис. 3.8), ДНК-полимераза [3] (рис. 3.9), тирозинаминотрансфераза [2] и сериндегидратаза [88] печени крыс при ответе на действие глюкозы, АКТГ и кортизона соответственно [5]. Лаг-период индукции тирозинаминотрансферазы после выдерживания при низкой температуре у старой мыши также увеличен [33].

Рис. 3.7. Зависимость ферментной адаптации от возраста [15]. В общем виде показаны четыре основных типа влияния старения на время протекания и величину гипотетических адаптивных изменений активности ферментов.

Сплошная линия — молодые животные, штриховая — среднего возраста, пунктирная — старые

Рис. 3.8. Зависимость лаг-периода индукции глюкокиназы от возраста крысы [4]

Рис. 3.9. Возрастные различия начала и максимума скорости синтеза ДНК в подчелюстной железе крысы после инъекции изопротеренола [3].

1 — возраст 2 мес; 2 — возраст 12 мес

У ферментов типа 2 степень индукции при одинаковой дозе индуктора в старческом возрасте или больше, или меньше. Индукция орнитин-оксокислота — аминотрансферазы кортизоном, глюкозо-6-фосфатазы в печени высокобелковым рационом [88], цитоплазматической малатдегидрогеназы адреналэктомированных крыс кортизоном [53] и орнитиндекарбоксилазы дексаметазоном [30] в старости значительно понижается. Экстремальные случаи такого понижения наблюдаются для митохондриальной малатдегидрогеназы [53] и аргиназы [90] печени после удаления надпочечника и введения кортизона и для ацетилхолинэстеразы мозга крысы [81] после овариэктомии и введения эстрадиола. Во всех этих случаях у старых животных наблюдается полное отсутствие индукции. Вместе с тем индукция глутаминсинтетазы кортизоном у старых крыс больше и в норме, и после удаления надпочечника [89]. Индукция в этих случаях исследовалась только одномоментно, и лаг-период ни для старых крыс, ни для крыс в среднем возрасте неизвестен.

У ферментов типа 3 в старости происходят изменения и величины индукции, и времени, необходимого для индукции. К этому типу относятся замедленное и более слабое повышение активности тимидинкиназы и дезокситимидилатсинтетазы из слюнных желез у крысы после введения изопротеринола [96] или у дрозофилы после обработки аминотриазолом [82].

Для ферментов типа 4 ответ на действие индуктора в среднем возрасте и в старости одинаков. К этому типу относится индукция глюкокиназы, тирозинаминотрансферазы [6] и митохондриальной глицерол-3-фосфат — дегидрогеназы [17] инсулином, кортизоном и тироксином соответственно.

Как и в случае содержания ферментов у нормальных животных, способность различных ферментов к индукции разными индукторами зависит, по-видимому, от линии и пола животных, времени измерения активности фермента, условий, в которых содержались животные, и их физиологического состояния. Однако очевидно, что в одной и той же популяции индукция некоторых ферментов может меняться. При этом может происходить изменение или величины, или лаг-периода, или того и другого вместе. Последовательность событий, начинающаяся с момента проникновения стероидного гормона в клетку-мишень и завершающаяся синтезом специфического белка, более или менее установлена. Гормон проникает в клетку-мишень и связывается со специфическим белковым рецептором в цитозоле, образуя комплекс гормон — рецептор (Г-Р). Этот комплекс проникает в ядро, где связывается со специфическими акцепторными центрами хроматина и стимулирует транскрипцию, после чего происходит синтез специфического белка (рис. 5.2). Необходимо точно определить то место (места) в этой последовательности событий, на котором в старческом возрасте происходит нарушение индукции стероидными гормонами.

Такая попытка была предпринята Канунго и его сотрудниками [54], которые показали, что эстрадиол накапливается в мозгу крысы. Введение эстрадиола (10 мкг/100 г) индуцирует ацетилхолинэстеразу в полушариях головного мозга незрелых и зрелых крыс после овариэктомии, но не влияет на синтез этого фермента у старых крыс [81]. Одной из возможных причин ухудшения индукции ацетилхолинэстеразы эстрадиолом в мозгу старой крысы может быть понижение содержания эстрадиол-связывающих рецепторных белков. Чтобы проверить это предположение, гомогенаты, полученные из полушария головного мозга 7-, 44- и 108-недельных крыс с удаленными яичниками, инкубировали с 3Н-эстрадиолом и количественно определяли эстрадиол-специфичный белок. Оказалось, что самое большое сродство этого белка к 17β-эстрадиолу характерно для головного мозга незрелых крыс, у которых наблюдается и самая сильная индукция ацетилхолинэстеразы (рис. 5.6) [56]. Сродство белка к эстрадиолу с возрастом понижается. Следовательно, одной из молекулярных причин ухудшения индукции ацетилхолинэстеразы эстрадиолом, по-видимому, является уменьшение содержания эстрадиол-специфического белка. Возникает вопрос: чем же вызывается это уменьшение? Известно, что эстрадиол стимулирует синтез своего собственного рецептора. Является ли понижение содержания специфического рецептора эстрадиола в мозгу крыс-самок следствием понижения содержания эстрадиола, которое, как известно, происходит в старости? У крыс-самцов уровень андрогена в старости также снижается. Влияет ли это на содержание ацетилхолинэстеразы в полушариях головного мозга? Если такое влияние существует, то для повышения содержания ацетилхолинэстеразы, жизненно важной для мозга, старым животным можно вводить стероидные гормоны.

Попытки повысить уровень определенных ферментов в мозгу старых крыс путем введения стероидных гормонов дали обнадеживающие результаты. Кастрация старых мужских и женских особей крыс понижает содержание в полушариях мозга двух жизненно важных ферментов, ответственных за проводимость нервов, — ацетилхолинэстеразы и холин-ацетилтрансферазы. Ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина, а холин-ацетилтрансфераза — его синтез. Введение 10 мкг тестостерона на 100 г веса повышает содержание того и другого фермента у старых крыс обоих полов приблизительно до уровня репродуктивного периода. В отношении индукции холин-ацетилтрансферазы тестостерон более эффективен, чем эстрадиол (рис. 5.9) [50]. Такие же результаты были получены для пируваткиназы мозга и сердца (рис. 5.8) [22, 23]. Поскольку в клетке есть ферменты, переводящие тестостерон в эстрадиол, неясно, происходит ли индукция благодаря тестостерону или эстрадиолу. Однако полученные результаты указывают путь управления уровнем специфических ферментов с помощью введения соответствующих количеств их индукторов.

Другим методом, который попытались применить для восстановления индукции ферментов у старых животных, был метод стимулирования регенерации ткани. Было показано, что активность митохондриальной малатдегидрогеназы понижается в печени молодых крыс после удаления надпочечника, но не меняется при этой же операции у старых животных [53]. Введение кортизона вызывает индукцию фермента у молодых крыс и не вызывает у старых. Однако если у старых крыс провести частичную гепатэктомию, дать печени возможность регенерировать в течение трех дней и затем ввести кортизон, то количество фермента увеличится. Таким образом, в отношении индукции митохондриальной малатдегидрогеназы регенерирующая печень старых крыс функционирует так же, как печень молодых. По-видимому, это нарушение индукции, связанное со старением, может быть ликвидировано. Наиболее значительным результатом этой работы является вывод о том, что молекулярные изменения, которые происходят в организме в процессе старения животного, могут быть обращены вспять. Однако клетки печени делятся на протяжении всей жизни, так как эти клетки являются премитотическими. Поэтому печень и способна к регенерации. Многие другие органы, такие, как мозг, сердце, скелетные мышцы, не могут регенерировать, так как их клетки теряют способность делиться на очень ранней стадии развития и становятся постмитотическими. Обратимы ли изменения, происходящие в старческом возрасте в этих органах?

В связи с упомянутыми исследованиями возникает еще один вопрос — обусловлено ли нарушение индукции малатдегидрогеназы в печени старых крыс уменьшением содержания специфических рецепторов кортизона или оно обусловлено репрессией гена малатдегидрогеназы? Поскольку активность малатдегидрогеназы в печени нормальных старых крыс высокая, появление репрессора в старческом возрасте, по-видимому, маловероятно. Чтобы ответить на поставленные вопросы, очевидно, важно измерить количество кортизон-специфического рецептора в печени старых крыс.

Описанные выше исследования показывают, что такие факторы, как гормоны и их рецепторы, важны для поддержания уровня и адаптивного ответа ферментов в различных возрастах. Изменения содержания этих факторов в старости могут вызывать изменения в транскрипции и трансляции и, таким образом, влиять на содержание ферментов. Это может в свою очередь приводить к функциональным сдвигам в органах и в организме в целом.

Молекулярные свойства ферментов

Измерения Км, Ki, молекулярной массы, электрофоретической подвижности, антигенности и тепловой инактивации ферментов дают ценную информацию об их молекулярных свойствах. При исследовании ферментов, выделенных из органов молодых и старых животных, подобные измерения полезны при решении вопроса о том, одинакова ли структура ферментов, синтезированных в старых и молодых организмах. Если структурные различия не наблюдаются, то, по-видимому, в течение всей жизни фермент кодируется одним и тем же геном, не претерпевающим структурных изменений. Если же различия есть, то это означает, что на различных стадиях жизни функционируют разные гены или же происходят изменения в нуклеотидах, вызывающие изменения кодонов. Вместе с тем такие ошибки в строении молекул белка, как замена аминокислот, могут вноситься в ходе синтеза белка. Для соответствующих исследований требуются в высокой степени очищенные ферменты. Трудность этих исследований заключается в том, что если изучаемый фермент имеет изоферменты и доминирующей формой в одном возрасте является один изофермент, а в другом — другой, то кинетические параметры фермента могут быть различны. Поэтому прежде всего нужно установить, имеет ли изучаемый фермент изоферменты. Если суметь преодолеть трудности, в подобных исследованиях можно получить полезную информацию.

Как функции возраста были измерены кинетические параметры только небольшого числа ферментов на неполностью очищенных препаратах. Это ацетилхолинэстераза [81] и пируваткиназа [22] мозга; миозиновая АТРаза [51, 105] и альдолаза скелетных мышц [38]; пероксид-дисмутаза [93], цитоплазматическая аланинаминотрансфераза [87] и альдолаза [39] печени млекопитающих.

В табл. 3.5 приведены различные кинетические параметры ферментов, выделенных из органов молодых и старых крыс. В целом видно, что существенной разницы в Км, Ki, молекулярной массе и электрофоретической подвижности нет. Однако удельная активность альдолазы [39] и пероксид-дисмутазы [93] старых крыс составляет только 30–70 % активности этих ферментов у крыс среднего возраста. Ферменты старых крыс, кроме того, более термолабильны. Эти различия были объяснены посттрансляционными модификациями [37].

Таблица 3.5. Сравнение кинетических свойств очищенных ферментов, полученных в молодом и старом возрасте

Поскольку были изучены молекулярные свойства только нескольких ферментов, определенных заключений сделать пока нельзя. Однако данные по тем ферментам, кинетические параметры которых известны, показывают, что в организмах молодых и старых животных синтезируются одни и те же молекулы. Следовательно, гены, ответственные за их синтез в разных возрастах, по-видимому, одни и те же. Небольшие различия, наблюдаемые в случаях аланинаминотрансферазы молодых и старых крыс, могут быть связаны со сменой форм изофермента, как это показано Патнайком и Канунго [87]. Различия в удельной активности и термолабильности пероксид-дисмутазы и альдолазы были отнесены к посттрансляционным модификациям [37] (гл. 9).

Была выдвинута и альтернативная точка зрения, заключающаяся в том, что старение происходит в результате прогрессивного нарастания с течением времени числа ошибок в молекулах белка. Эта точка зрения основана на том, что с возрастом постепенно увеличивается неактивная фракция молекул фермента [47, 48, 84] (гл. 9). С ней трудно согласовать понижение в старости удельной активности пероксид-дисмутазы, с одной стороны, и повышение удельной активности миозиновой АТРазы — с другой. В последнем случае Км и Vmax в старости повышаются, что может происходить благодаря конформационным изменениям, индуцированным эффектором. Ряд авторов считает [44, 93], что некоторые изменения кинетических параметров пероксид-дисмутазы и фосфоглицераткиназы нельзя объяснить ошибками в синтезе; скорее всего, они возникают из-за посттрансляционных модификаций — таких, как фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и т. д. Было бы интересно выяснить, каким образом в старости происходят такие посттрансляционные модификации (детальное обсуждение этого вопроса приведено в гл. 9).

Резюме

Как функции возраста животных были изучены различные аспекты функционирования ферментов — их активность, формы изоферментов, индукция, кинетические параметры. Активность некоторых ферментов, выраженная в Ед.·мг-1 белка и в Ед.·мг-1 ДНК, в старости понижается, в то время как других — повышается. Для некоторых ферментов никаких изменений не обнаруживается. Не выявлено никаких специфических закономерностей в изменениях ферментов отдельных классов, одного и того же органа или клеточной органеллы. Поскольку каждый метаболический путь включает в себя ферменты, относящиеся к различным классам, особую ценность имеют исследования всех ферментов данного пути в одинаковых условиях.

Изучение изменения набора изоферментов дало полезную информацию о типах изменений, которые происходят на уровне генома и ответственны не только за смену изоферментов, но также и за активность ферментов. Смена изоферментов может нарушить точный и тонкий контроль метаболических путей из-за различий изоферментов в сродстве к субстратам и эффекторам. Это может вызывать значительные изменения в активности метаболических процессов и приводить к функциональным изменениям всего организма. Сдвиг к Н4-ЛДГ в мозгу, сердце и скелетных мышцах крысы в старости может сделать эти ткани более аэробными. Сдвиг к цААТ-В в печени крысы в старости таким же образом может вызвать изменение в метаболизме аминокислот. Повышение относительного содержания некоторых изоферментов свидетельствует о повышении активности соответствующих генов. Такие изменения в функции гена в старости могут быть вызваны появлением или исчезновением в этом возрасте ряда факторов или эффекторов.

Изучение индукции ферментов, особенно стероидными гормонами, показывает, что в целом в старости степень индукции снижается. В некоторых случаях удается повернуть вспять это понижение путем введения необходимого количества гормонов. Вероятно, снижение индукции ацетилхолинэстеразы эстрадиолом в старости происходит благодаря уменьшению уровня эстрадиолспецифического рецептора. В некоторых тканях, таких, как печень, возможно восстановление индукции путем стимулирования регенерации ткани. Исследования в этой области показывают, что изменения в старости активности ферментов и форм их изоферментов обратимы, и, по-видимому, возможно их возвращение к уровням, свойственным среднему возрасту.

При изучении кинетических и молекулярных свойств нескольких ферментов было обнаружено, что ряд свойств: Км, Ki, молекулярная масса и электрофоретическая подвижность — у старых и молодых животных одинаковы. Однако удельная активность нескольких изученных к настоящему моменту ферментов в старости снижается, а их термочувствительность возрастает. Это может объясняться посттрансляционными модификациями. Следовательно, за синтез фермента на протяжении всей жизни отвечает один и тот же ген. Эти исследования, а также изучение изоферментов и индукции свидетельствуют в пользу той точки зрения, согласно которой изменения в содержании ферментов, наблюдаемые в старости, происходят благодаря регуляции активности соответствующих генов, которые, по-видимому, стимулируются факторами, появляющимися или исчезающими по окончании репродуктивного периода. Подобные изменения могут вызывать вырождение функций или понижение способности организма адаптироваться к эндогенным и экзогенным факторам.

Литература

1. Adelman R. C. J. biol. Chem., 245, 1032–1035 (1970).

2. Adelman R. C. Nature, 228, 1095–1096 (1970).

3. Adelman R. C. Expl. Gerontol., 6, 75–87 (1971).

4. Adelman R. C. Adv. Gerontol. Res., 4, 1-23 (1972).

5. Adelman R. C. In: Enzyme Induction (D. V. Parke, Ed.), 303–311, Plenum Press, New York (1975).

6. Baker G. T., III. Expl. Gerontol., 10, 231–237 (1975).

7. Barrows C. H., Roeder L. M. J. Gerontol., 16, 321–325 (1961).

8. Barrows C. H., Falzone J. A., Shock N. W. J. Gerontol., 15, 130–133 (1960).

9. Barrows C. H., Roeder L. M., Falzone J. A. J. Gerontol., 17, 144–147 (1962).

10. Beauchene R. W., Fanestil D. D., Barrows C. H. J. Gerontol, 20, 306–310 (1965).

11. Beauchene R. W., Roeder L. M., Barrows C. H. J. Gerontol., 22, 318 (1967).

12. Beckendorf G. W., Stephen W. P. Biochim. Biophys. Acta, 201, 101–108 (1970).

13. Beezeley A. E., McCarthy J. L., Sohal R. S. Expl. Gerontol., 9, 71–74 (1974).

14. Bolla R., Brot N. Arch. Biochem. Biophys., 169, 227–236 (1975).

15. Brun A., Hultberg B. Mech. Age. Dev., 4, 201–213 (1975).

16. Bulos B., Sacktor B., Grossman I. W., Alt man N. J. Gerontol 26, 13 (1971).

17. Bulos B., Shukla S., Sacktor B. Mech. Age. Dev., 1, 227–232 (1972).

18. Bulos b., Shukla S., Sacktor B. Arch. Biochem. Biophys., 166, 639–644 (1975).

19. Cahn R. D., Kaplan N. O., LeVine L., Zwilling E. Science, 136, 962–969 (1962).

20. Chainy G. B. N. Metabolic changes during ageing, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University (1977).

21. Chainy G. B. N., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun 72, 777–781 (1976).

22. Chainy G. B. N., Kanungo M. S. J. Neurochem., 30, 419–427 (1978).

23. Chainy G. B. N., Kanungo M. S. Biochim. Biophys. Acta, 540, 65–72 (1978).

24. Chen S. H., Gibleit E. R. Science, 173, 148–149 (1971).

25. Cheskey J. F. Expl. Gerontol, 10, 165–169 (1975).

26. Dawson D. M., Goodfriend T. L., Kaplan N. O. Science, 143, 929–933 (1964).

27. Dunn G. R., Wilson T. G., Jacobson K. B. J. exp. Zool., 171, 185–190 (1969).

28. Eppenberger H. M., Eppenberger M., Richterich R., Aelei H. Devi. Biol., 10, 1-16 (1964).

29. Erlanger M., Gershon D. Expl. Gerontol., 10, 231–237 (1970).

30. Ferioli M. E., Ceruti G., Comolli R. Exptl. Gerontol., 11, 153–156 (1976).

31. Filler R., Criss W. E. Biochem. J., 122, 553–555 (1971).

32. Finch C. E. Expl. Gerontol., 7, 53–67 (1972).

33. Finch C. E., Foster J. R., Mirsky A. E. J. Gen. Physiol., 54, 690–712 (1969).

34. Florini J. R. Exp. Aging Res., 1, 137–144 (1975).

35. Franklin T. J. Biochem. J., 82, 118–122 (1962).

36. Gandhi B. S. Biochemical changes in aging rats: Malate dehydrogenase and monoamine oxidase, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University (1972).

37. Gershon D. Mech. Age. Dev., 9, 189–196 (1979).

38. Gershon H., Gershon D. Mech. Age. Dev., 2, 33–42 (1973).

39. Gershon H., Gershon D. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 909–913 (1973).

40. Goodfriend F., Kaplan N. O. J. biol. Chem., 239, 130–135 (1964).

41. Goodfriend T. L., Sokol D. M., Kaplan N. O. J. molec. Biol, 15, 18–31 (1966).

42. Gregerman R. I. Amer. J. Physiol, 137, 63–64 (1959).

43. Gupta S. K., Rothstein M. Arch. Biochem. Biophys, 174, 333–338 (1976).

44. Gupta S. K., Rothstein M. Biochim. Biophys. Acta, 445, 632–644 (1976).

45. Hall J. C. Expl. Gerontol, 4, 207–222 (1969).

46. Hollander J., Barrows C. H., Jr. J. Gerontol, 23, 174–179 (1968).

47. Holliday R. Nature, 221, 1224–1228 (1969).

48. Holliday R., Tarrant G. M. Nature, 238, 26–30 (1972).

49. lmamura K., Taniuchi K., Tanaka T. J. Biochem, 72, 1001–1015 (1972).

50. James T. C, Kanungo M. S. Biochim. Biophys. Acta, 538, 205–211 (1978).

51. Kaldor G., Min B. K. Fed. Proc, 34, 191–194 (1975).

52. Kanungo M. S. Biochem. Rev, 41, 13–23 (1970).

53. Kanungo M. S, Gandhi B. S. Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 69, 2035–2038 (1972).

54. Kanungo M. S, Patnaik S. K. In: Regulation of Growth and Differentiated Function in Eukaryote Cells (G. P. Talwar, Ed.), 479–490, Raven Press, New York (1975).

55. Kanungo M. S., Singh S. N. Biochem. Biophys. Res. Commun, 21, 454–459 (1965).

56. Kanungo M. S., Patnaik S. K., Koul O. Nature, 253, 366–367 (1975).

57. Kaur G., Kanungo M. S. Can. J. Biochem, 48, 203–206 (1970).

58. Kaur G, Kanungo M. S. Ind. J. Biochem, 7, 122–125 (1970).

59. Kirk J. E. 4th Int. Congr. Geront, 1, 288–291 (1957).

60. Kirk J. E. Ann. N. Y. Acad. Sci, 72, 1006–1015 (1959).

61. Kirk J. E. J. Gerontol, 14, 288–291 (1959).

62. Kirk J. E. J. Gerontol, 14, 181–188 (1959).

63. Kirk J. E. 1. Gerontol, 14, 447–449 (1959).

64. Kirk J. E. J. Gerontol, 16, 25–28 (1961).

65. Kirk J. E. J. Gerontol, 16, 243–246 (1961).

66. Kirk J. E. J. Gerontol, 17, 154–157 (1962).

67. Kirk J. E. Weselowski and Dennis Fundamentals of Vascular Ageing, 32–62, McGraw-Hill, New York (1963).

68. Kirk J. E. J. Gerontol, 20, 357–362 (1965).

69. Kirk J. E. J. Gerontol, 21, 420–425 (1966).

70. Kirk J. E., Ritz E. J. Gerontol, 22, 427–438 (1967).

71. Kirk J. E., Wang N. S., Brandstrupp N. J. Gerontol, 14, 25–31 (1959).

72. Koida M., Lai C. Y., Horecker B. L. Arch. Biochem. Biophys, 134, 623–631 (1969).

73. Kurnick N. B., Kernen R. L. J. Gerontol., 17, 245–253 (1962).

74. Lang C. A., Stephen J. K. Biochem. J., 102, 331–337 (1967).

75. Latner A. L, Skillen A. W. J. Embryol. Exp. Morphol., 12, 501 (1964).

76. Maier N., Haimovici H. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 95, 425–429 (1957).

77. Mainwaring W. I. P. Gerontologia, 14, 133 (1968).

78. Marked C. L., Möller F. Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 45, 753–762 (1959).

79. Marked C. L., Ursprung H. Devi. Biol., 5, 363–381 (1962).

80. Mays L. L., Borek E., Finch C. E. Nature., 248, 411–413 (1973).

81. Moudgil V. K., Kanungo M. S. Biochim. Biophys. Acta, 329, 211–220 (1973).

82. Nicolosi R. J., Baird M. B., Massie H. R., Samis H. V. Expl. Gerontol., 8, 101–108 (1973).

83. Oeriu S., Cotescu G., Teodorescu O., Soimu I. Studii Cere. Biochim., 5, 337–340 (1962).

84. Orgel L. E. Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 49, 517–521 (1963).

85. Osterman J., Fritz P. J., Wuntch T. J. biol. Chem., 248, 1011–1018 (1973).

86. Patnaik S. K., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 845–850 (1974).

87. Patnaik S. K., Kanungo M. S. Ind. J. Biochem. Biophys., 13, 117–124 (1976).

88. Rahman Y. E., Peraino C. Expl. Gerontol., 8, 93-100 (1973).

89. Rao S. 5, Kanungo M. S. Mech. Age. Dev., 1, 61–70 (1972).

90. Rao S. S., Kanungo M. S. Ind. J. Biochem. Biophys., 11, 208–212 (1974).

91. Ratha B. K., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 925–929 (1977).

92. Reiss U., Rothstein M. J. biol. Chem., 250, 826–830 (1975).

93. Reiss U., Gershon D. Eur. J. Biochem. 63, 617–623 (1976).

94. Ritz E., Kirk J. E. J. Gerontol, 22, 433–438 (1967).

95. Ross M. H., Ely J. O. J. Franklin Inst., 285, 63–66 (1954).

96. Roth G. S., Karoly K., Britton V. J., Adelman R. C. Expl. Gerontol., 9, 1-12 (1974).

97. Schmuckler M., Barrows C. H., Jr. J. Gerontol., 21, 109–111 (1966).

98. Schmuckler M., Barrows C. H., Jr. J. Gerontol., 22, 13 (1967).

99. Shaw C. R., Barto E. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 50, 211–214 (1963).

100. Singh S. N., Kanungo M. S. J. biol. Chem., 243, 4526–4529 (1968).

101. Singhal R. L. J. Gerontol., 22, 77–82 (1967).

102. Singhal R. L. J. Gerontol., 22, 343–347 (1967).

103. Singhal R. L., Valadares J. R. E., Ling G. M. Amer. J. Physiol., 217, 793–797 (1969).

104. Sohal R. S., McCarthy J. M. Expl. Gerontol., 8, 223–227 (1973).

105. Srivastava S. K. Biochemical changes in rats during aging: muscle proteins: Creatine phosphokinase, Myosin and Actin, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University (1977).

106. Steinhagen-Thiessen E., Hilz H. Mech. Age. Dev., 5, 447–457 (1976).

107. Steward F. C. Science., 143, 20–27 (1964).

108. Turner D. C., Eppenberger H. M. Enzyme, 15, 224–238 (1973).

109. Wang K., Kirk J. E. J. Gerontol, 14, 444–446 (1959).

110. Wieland T., Pfleiderer H. Biochem. Z., 329, 112–116 (1957).

111. Wilson P. D. Gerontologia, 18, 46–54 (1972).

112. Wilson P. D. Gerontologia, 19, 79-125 (1973).

113. Wilson P. D., Franks L. H. Gerontologia, 17, 16–32 (1971).

114. Zorzoli A. J. Gerontol., 17, 359–362 (1962).

115. Zorzoli A., Li J. B. J. Gerontol., 22, 151 (1967).

116. Zuckerkandl E. Sci. American, 212, 110–118 (1965).

Глава 4. Изменения коллагена

Введение

Коллаген — это структурный белок, имеющий волокнистое строение. Он является самым распространенным белком в животных организмах и составляет 20–25 % всего содержания белков. Он синтезируется в клетках всех типов, однако откладывается в тканях во внеклеточном пространстве. Некоторые ткани, например сухожилия и связки, состоят в основном из коллагена. Следовательно, изменение этого белка с возрастом играет важную роль в процессе старения. Поэтому Верцар и начал в 50-х годах систематические исследования, целью которых было выяснить, меняются ли свойства этого белка при увеличении возраста животного. Он установил, что бороздчатость сухожилия хвоста крысы и сила термического сокращения сухожилия с возрастом увеличиваются (рис. 4.1), а его растворимость уменьшается [87, 88, 92]. Это свидетельствует о том, что полипептидные цепи коллагена в старческом возрасте имеют повышенное содержание поперечных сшивок. Эти наблюдения привели Верцара к созданию коллагеновой теории старения [89, 90]. Согласно этой теории, увеличение числа ковалентных поперечных сшивок в коллагене при увеличении возраста животного делает белок менее растворимым. Вследствие этого он накапливается в тканях в ущерб клеткам, вызывая нарушения в функционировании органов и всего организма. Эта теория стимулировала исследования молекулярных изменений коллагена и других родственных ему белков как функции возраста. Кроме того, коллаген широко использовали как модельный белок для изучения процесса старения благодаря тому, что его легко извлечь и легко получить в больших количествах из сухожилий и других соединительных тканей. Был опубликован ряд обзоров, посвященных разным аспектам изучения коллагена [4, 5, 10, 11, 21, 24, 27–30, 32, 62, 76, 78, 90].

Рис. 4.1. Влияние возраста на силу сокращения волокон коллагена хвоста крысы при нагревании [92]. По оси ординат отложен вес груза, требующегося для предотвращения сокращения при нагревании волокон, по оси абсцисс — возраст. · здоровые животные; † животные, самопроизвольно умершие

Коллаген — основной компонент всех соединительных тканей. Будучи внеклеточным белком, он не обновляется при делении клеток, и его запас не возобновляется, как это имеет место для внутриклеточных белков. Его растворимость с возрастом животных постепенно уменьшается, как это показано на рис. 4.2 [20]. Кроме того, растет доля тримеров полипептидных цепей по сравнению с димерами и мономерами, что указывает на увеличивающееся число межмолекулярных сшивок (рис. 4.3 и 4.4) [16]. Действительно, увеличение количества нерастворимого коллагена в сухожилии человека с возрастом происходит настолько закономерно, что, измеряя количество коллагена, устойчивого по отношению к коллагеназе, можно определять его возраст [33]. Некоторые физические свойства белка резко меняются. Помимо увеличения напряжения, которое развивается в сухожилии при термическом сокращении при 65 °C (рис. 4.5), возрастает время, которое требуется для его разрыва при определенной нагрузке (рис. 4.6), а время сокращения уменьшается.

Рис. 4.2. Влияние возраста на растворимость коллагена сухожилия хвоста (промытого фосфорной кислотой) в воде при 65 °C в течение 10 мин для интактных крыс (I) и крыс, лишенных гипофиза (II) [20]

Рис. 4.3. Увеличение с возрастом суммарного веса коллагена в сухожилии хвоста и количества нерастворимого коллагена [16]. С помощью гель-фильтрации образцов на биогеле А-15 показано увеличение с возрастом количества нерастворимого коллагена и соответствующее уменьшение α-субъединиц

Рис. 4.4. Распределение α-цепей и коллагена других типов в коже крыс разного возраста [36]

Рис. 4.5. Зависимость веса груза, который может поднять сухожилие крысы при сокращении, от возраста [89]. Предел прочности при растяжении (или сила сокращения) равномерно увеличивается с возрастом

Рис. 4.6. Увеличение с возрастом времени, которое требуется для разрыва изолированного волокна коллагена из сухожилия хвоста крысы в 7 М мочевине при 40 °C и рН 7,0; вес груза 2 г [22]

Коллаген является главным органическим компонентом экстрацеллюлярного матрикса, в особенности соединительных тканей, таких, как кости и хрящи. Он служит как бы "лесами" для клеток при построении этих тканей и выполняет механические и защитные функции.

При старении млекопитающих обычно наблюдаются увеличение числа морщин на коже, уменьшение костной массы и увеличение хрупкости костей, а также изменение физических свойств хрусталика. Происходит ли это благодаря появлению с возрастом новых типов коллагена или благодаря прогрессирующим посттрансляционным изменениям в макромолекулах коллагена, вызывающим потерю функций ткани? Если верна первое, то это может означать, что перечисленные выше изменения свойств коллагена происходят из-за изменений первичных центров, т. е. в пожилом возрасте происходит экспрессия генов, ответственных за синтез нерастворимого коллагена. Если же верно второе предположение, то причина старения имеет вторичный характер. Изменения физических свойств коллагена по мере старения животного в этом случае могут происходить из-за изменений с возрастом уровней эффекторов, что приводит к модификации свойств коллагена уже после его синтеза. Таким образом, для того чтобы разобраться в изменении свойств коллагена как функции возраста, необходимо знать его молекулярную структуру.

Молекулярная структура

Внеклеточный коллаген представляет собой фибриллы, состоящие из нескольких мономеров. Каждый мономер — это тройная спираль из трех полипептидных цепей, свернутых друг относительно друга. В коллагене разных тканей найдено два типа полипептидных цепей — α1 и α2. Цепи α1 имеют четыре варианта — α1(I), α1(II), α1(III) и α1(IV). Четыре варианта α1 и цепи типа α2 различают последовательностью аминокислот и, следовательно, кодируются разными генами.

Каждая α-цепь состоит из ~1050 аминокислотных остатков и имеет мол. массу 100000. Приблизительно 15–25 остатков в каждом из NH2- и COOH-концевых участков α-цепи имеют последовательность, не свойственную коллагену и не имеющую формы спирали. Эти концевые участки называются: телопептидами. В отличие от центральных спиральных областей цепи, характерных для коллагена, они не содержат Gly в каждом третьем положении. На NH2-конце находится пептид Lys9, сохранившийся в ходе эволюции. Он превращается вне клетки в аллизин, принимает участие в образовании поперечных сшивок с α-цепью другого мономера коллагена и, следовательно, в формировании фибриллы. COOH-концевая область также содержит сохранившийся в ходе эволюции Lys1044, участвующий в образовании сшивки внутри мономера и в формировании фибриллы [57].

Центральная часть α-цепи состоит из ~1000 остатков, соединенных в повторяющейся последовательности Gly — X-Y, т. е. Gly занимает каждое третье положение. Таким образом, всего в α-цепи около 337 глициновых остатков, составляющих одну треть всех аминокислот коллагена. Положение X и Y занимают другие аминокислоты. Часто встречаются также аминокислоты пролин (Pro) и оксипролин (Hyp). Pro занимает положение X, а Hyp — положение Y. Обычно Hyp гидроксилирован по четвертому углеродному атому. Разные типы α-цепей отличаются друг от друга аминокислотами в положениях X и Y. Наличие Gly и его присутствие в каждом третьем положении характерны для всех цепей, тогда как содержание Hyp и Pro в разных α-цепях различно.

Чем выше суммарное содержание Hyp+Pro, тем выше температура плавления (Tm) коллагена и его стабильность (Tm — температура, при которой разрушается 50 % спиральной структуры):

В отличие от глобулярных белков α-цепи не имеют водородных связей внутри цепи. Таким образом, в них отсутствуют α-cпирали и они представляют собой β-структуры. Если у глобулярных белков, имеющих α-спиральную структуру, приходится 5,4 аминокислотных остатков на виток, а подъем на один остаток равен 0,15 нм, для α-цепей коллагена эти значения составляют 3,3 остатка и 0,29 нм соответственно. Каждая цепь имеет левые витки с шагом 0,9 нм, содержащим три остатка.

Три α-цепи, уложенные параллельно, образуют тройную спираль мономера коллагена. Вокруг центральной оси они расположены таким образом, что каждая закручена относительно другой влево. Три цепи удерживаются друг возле друга водородными связями. Несмотря на то что энергия Н-связей составляет всего 3–5 ккал/моль, существование большого числа таких связей (две Н-связи на три остатка) обеспечивает удерживание трех цепей рядом, причем именно водородные связи ответственны за структуру тройной спирали. Это оказывается возможным благодаря наличию в каждом третьем положении Gly. У глицина нет боковых групп, а его атом водорода при α-углеродном атоме расположен в пространстве между цепями. Азот иминогруппы Gly одной цепи связан Н-связью с карбонильным (кислородом Gly другой цепи (рис. 4.7). Любая другая аминокислота препятствовала бы образованию Н-связи между цепями и закручиванию цепей. Hyp также образует Н-связи между цепями через молекулы воды и, следовательно, тоже вносит вклад в стабильность мономера [63]. Коллаген, в котором Pro не гидроксилирован, имеет Tm в интервале 20–25 °C. Если Pro гидроксилирован, то Tm коллагена равна 37 °C. Таким образом, структура тройной спирали коллагенового мономера поддерживается в значительной степени благодаря водородным связям.

Рис. 4.7. Водородные связи в тройной спирали коллагена [63]. Предполагается образование водородных связей двух типов: 1) однократно связанных структур между группами NH цепи А и С=О цепи Б; 2) дважды связанных структур с водным мостиком между группой NH цепи Б, связанной водородной связью с кислородом молекулы воды, которая в свою очередь связана с кислородом цепи А. Кроме того, вторая молекула воды связывает атомы кислорода цепи А и цепи Б

Фибрилла коллагена состоит из нескольких мономеров. Мономеры объединяются двумя способами. Они располагаются конец-в-конец, причем NH2-конец одной цепи обращен к COOH-концу другой. Цепи лежат рядом, но сдвинуты друг относительно друга на 234 остатка, что соответствует 66,7 нм. Этот сдвиг, или период, обозначают "D". Мономеры, расположенные рядом, удерживаются ковалентными поперечными связями, образованными модифицированными лизиновыми остатками. Упомянутый выше сдвиг таков, что Lys9 α-цепи одного мономера располагается против Lys934 α-цепи соседнего мономера; между этими лизинами образуется ковалентная поперечная сшивка, благодаря которой мономеры удерживаются рядом.

Между мономерами, расположенными конец-в-конец, имеется зазор ~30 нм (~0,4D). Поэтому мономер одной линейной последовательности налагается на соседней мономер со сдвигом ~0,4 D. Эти зазоры и наложения чередуются, что выявляется на электронных микрофотографиях фибрилл коллагена в виде светлых (зазор) и темных (наложение) линий. Этим и объясняется бороздчатый вид фибрилл на электронных микрофотографиях (рис. 4.8).

Рис. 4.8. Электронная микрофотография микрофибриллы коллагена, окрашенной фосфорновольфрамовой кислотой [32]. Видна бороздчатость микрофибриллы

Каждый мономер коллагена имеет длину 300 нм и диаметр 1,5 нм. Пять мономеров со сдвигом друг относительно друга D образуют микрофибриллу диаметром ~4 нм. Микрофибриллы закручены в спираль с шагом 70 нм. Несколько микрофибрилл образуют фибриллу, диаметр которой зависит от числа микро-фибрилл [37, 47, 58, 82, 94].

Типы коллагена и их распределение

В тканях встречается коллаген четырех основных типов, характеризующихся разной структурой объединения α-цепей в тройные спирали (табл. 4.1). Коллагену, подобно некоторым ферментам, которые существуют в виде изоферментов, присущ молекулярный полиморфизм. Существует 5 типов α-цепей, и, следовательно, возможно образование 35 разных тройных спиралей. Почему образуются только четыре типа — неизвестно.

Таблица 4.1. Типы, строение, локализация и характеристики коллагена

Жесткие ткани — кости, сухожилия, кожа — содержат коллаген типа I, молекула которого состоит из двух цепей α1(I) и одной α2. Эти мономеры образуют плотноупакованные шероховатые фибриллы, и на их электронных микрофотографиях видны обычные поперечные полосы (рис. 4.8). Это наиболее распространенный тип коллагена у позвоночных. Пластичные ткани — кожа зародышей, гладкие мышцы (матки и пищеварительного тракта), кровеносные сосуды, легкие, связки и хрусталик — кроме коллагена типа I содержат коллаген типа III. В этих тканях коллаген состоит из трех цепей α1(III), а фибриллы расположены хаотически. Соотношение коллагена типа I и типа III в них равно (2–3):1. Коллаген типа III синтезируется на ранних стадиях заживления ран, но по мере созревания рубца его синтез сокращается и постепенно увеличивается синтез коллагена типа I.

В каждой ткани преобладает коллаген какого-либо одного типа. Пульпозное ядро межпозвоночных дисков человека содержит только коллаген типа II, а окружающее ядро фиброзное кольцо — коллаген типа I и II [23]. При некоторых заболеваниях уменьшается доля коллагена типа III [71], Кожа зародыша содержит больше коллагена типа III, чем типа I, а у взрослых соотношение меняется на обратное [19].

Синтез коллагена

Внутриклеточные процессы

В опытах по гибридизации соматических клеток с использованием фибробластов человека и мыши установлено, что гены, ответственные за синтез коллагена типа I и III человека, расположены в разных хромосомах [61]. α-Цепь каждого типа кодируется отдельной моноцистронной мРНК. Следовательно, разные α-цепи кодируются разными генами [18]. Изучение гибридизации РНК-ДНК с использованием кДНК, полученной с помощью мРНК для про-α-цепей, показало, что для α-цепи каждого типа есть только один ген [26]. мРНК для про-α-цепи содержит ~4500 нуклеотидов и имеет на 3′-конце полиадениловый "хвост" длиной ~150 нуклеотидов [35]. Предшественник коллагена — проколлаген (про-α) транслируется с мРНК на полирибосоме в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме примерно за 4,8 мин. Про-α1 и про-α2 синтезируются на отдельных полирибосомах.

Про-α состоит из ~1500 остатков и имеет мол. массу ~150000. Он имеет NH2- и COOH-концевые участки, NH2-пропептид и COOH-пропептид, к которым присоединены короткие телопептиды в 15–25 остатков (рис. 4.9). Структура этих участков отличается от структуры, свойственной коллагену, и характеризуется отсутствием спиральной конформации.

Рис. 4.9. Биосинтез коллагена. Про-α-цепи синтезируются на полирибосомах. Эти цепи имеют концевые неспиральные участки, в которых нет типичной для коллагена последовательности Gly-X-Y. Про-α-цепи объединяются в клетках в тройную спираль проколлагена за счет образования водородных связей, а затем выделяются в межклеточный матрикс. Специфические пептидазы удаляют с обоих концов проколлагена пропептиды, в результате чего образуется мономер коллагена. Лизиновые остатки модифицируются ферментами и образуют ковалентные связи между цепями. Мономеры коллагена объединяются в микрофибриллы. Мономеры удерживаются друг около друга ковалентными поперечными сшивками между модифицированными лизиновыми остатками. АК — аминокислота

Возможно, NH2-пропептид сигнализирует о секреции, как это имеет место в случае других секреторных белков. Некоторые пролиновые и лизинговые остатки в ходе трансляции гидроксилируются. Гидроксилирование происходит даже по окончании трансляции. В NH2- и COOH-пропептидных областях коллагена всех типов присутствуют цистеиновые остатки [34]. Они образуют S — S-связи между цепями и способствуют выстраиванию α-цепей при образовании тройной спирали [60]. Из клетки выходят только правильно построенные тройные спирали. Следовательно, образование S — S-ковалентных связей между цепями помогает не только выстраиванию, но и секреции мономеров [68]. Некоторые гидроксилированные Lys перед формированием тройной спирали гликозилируются [12]. Степень гидроксилирования Pro и Lys и гликозилирования оксилизина (Hyl) соответствует ряду: тип III>тип II>тип I. Время, которое требуется на эти модификации, также подчиняется этому порядку.

Гидроксилирование пролина

Гидроксилирование Pro стабилизирует тройную спираль. Эту реакцию катализирует пролилгидроксилаза [40, 60] — фермент, связанный с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Фермент, выделенный из куриных эмбрионов, имеет мол. массу 230 000. Он представляет собой тетрамер, состоящий из мономерных субъединиц двух типов — с мол. массой 60000 и 64000 [60]. Мономер неактивен. Молекула фермента имеет сильно выраженные кислотные свойства, ее pI=4,4. Пролингидроксилаза катализирует превращения только пептидилпролина, по отношению к свободному пролину она неактивна. Этот фермент является оксигеназой со смешанными функциями. Для его активирования требуются молекулярный кислород, Fe2+, α-кетоглутаровая и аскорбиновая кислоты. Одновременно с гидроксилированием пролина α-кетоглутаровая кислота окислительно декарбоксилируется с образованием сукцината. При этом выделяется CO2, количество которого измеряют при определении активности фермента. Кислород расходуется в реакции прямого замещения в положении С-4 пролинового остатка. Есть сообщение [52], что аскорбиновая кислота нужна не для самой реакции гидроксилирования, а для последующего восстановления железа в ферменте. Субстраты связываются с ферментом в следующем порядке: Fe2+, α-кетоглутаровая кислота, кислород, полипептид. Гидроксилирование происходит только после того, как все четыре субстрата связались с ферментом. Продукты удаляются в следующем порядке: гидроксилированный пептид, CO2, сукцинат. Аскорбат не расходуется стехиометрически. Он ассоциирует с ферментом либо до связывания железа, либо после удаления одного или двух продуктов [86]. In vitro несколько пролиновых остатков гидроксилируются в отсутствие аскорбата. По-видимому, аскорбат не является необходимым для гидроксилирования [64]. Он требуется для регенерации железа в восстановленной форме. При недостатке аскорбиновой кислоты цепи коллагена гидроксилируются не полностью [8].

Пролиновые остатки гидроксилированы в основном в положении С-4, но в некоторой степени — и в положении С-3. В коллагене типа I и II С-3-гидроксилированный атом встречается только в соотношении 1 на цепь, а в коллагене типа IV-10- 15 на цепь. В реакциях гидроксилирования этих двух видов участвуют два разных фермента [84]. При ингибировании гидроксилирования пролина предотвращается образование тройной спирали мономера и уменьшается ее стабильность. Кроме того, при таком ингибировании коллаген не накапливается в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме и не выделяется из клетки. Гидроксилирование происходит до образования тройной спирали, так как было показано, что она не является субстратом в реакции гидроксилирования [10]. Гидроксилирование пролина можно предотвратить включением его аналогов, ограничением количества кислорода и связыванием железа в хелат. В заключение отметим, что гидроксилирование пролина является ключевым фактором в регуляции биосинтеза коллагена и в формировании его структуры.

Гидроксилирование лизинового остатка

Лизин включается в про-α-цепи в ходе трансляции. Его гидроксилирование катализируется лизилгидроксилазой [48]. Фермент, выделенный из куриных эмбрионов, имеет мол. массу 550000 и 200000 [60]. Как и для пролилгидроксилазы, для его активации необходимы молекулярный кислород, α-кетоглутаровая кислота, Fe2+ и аскорбиновая кислота. Обе гидроксилазы имеют близкие значения КМ. Они обратимо ингибируются n-хлормеркурибензоатом (nХМВ), что указывает на участие в катализе SH-групп фермента. Дитиотрейтол увеличивает активность обеих гидроксилаз. Как и гидроксилирование пролина, гидроксилирование лизиновых остатков происходит до образования тройной спирали. Обе гидроксилазы, выделенные из изолированных клеток сухожилия куриных эмбрионов, ингибируются гидрокортизонацетатом [55]. Последний ингибирует также синтез коллагена, причем это ингибирование обратимо. Содержание гидроксилизина (Hyl) различно в коллагене разных типов и с возрастом увеличивается [6]. При недостатке витамина D содержание Hyl в коллагене растет [80].

Если гидроксилирование пролина необходимо для формирования тройной спирали, то гидроксилирование лизина нужно для образования ковалентных поперечных сшивок между цепями, которое происходит вне клетки. Остатки Hyl, кроме того, служат центрами присоединения Сахаров. Недостаток лизилгидроксилазы в организме приводит к нарушениям в структуре соединительных тканей, при которых наблюдаются аномальные механические свойства кожи и связок (синдром Элерса — Данлоса). В ходе развития организма уровень лизилгидроксилазы понижается [7]. Таким образом, она также может быть ключевым фактором в регуляции биосинтеза коллагена и в формировании его структуры.

Гликозилирование проколлагена

Гликозилирование проколлагена — это посттрансляционная модификация про-α-цепей, которая представляет собой ферментативный процесс, протекающий внутриклеточно в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме до того, как тройная спираль проколлагена выйдет из клетки. В молекуле коллагена есть галактозилоксилизиновые и глюкозилгалактозилоксилизиновые остатки. Галактозиловая группа связана 0-гликозидной связью с гидроксильной группой Hyl (0-β-D-галактопиранозилоксилизин). Вблизи центра гликозилирования наблюдается характерная последовательность аминокислот: Gly — X - Hyl — Arg [49]. Считают, что эта область может быть носителем главной антигенной детерминанты коллагена. Вносит ли гликозилирование свой вклад в образование сшивок между цепями и (или) в соединение мономеров при формировании фибрилл коллагена, неизвестно.

В реакции гликозилирования принимают участие ферменты галактозилтрансфераза и глюкозилтрансфераза. Они переносят галактозиловый и глюкозиловый остатки UDPгликозида на оксилизин и галактозилоксилизин про-α-цепей в цистернах шероховатого эндоплазматического ретикулума. Кофактором для того и другого фермента служит Mn2+. Глюкозилтрансфераза представляет собой одиночную цепь с мол. массой 70000. Этот фермент высоко специфичен и катализирует только перенос глюкозы на галактозиловый остаток про-α-цепи [1, 2]. Субстратом для обоих ферментов является только одиночная про-α-цепь. Ни тройная спираль мономера проколлагена, ни свободный Hyl не гликозилируются. Кроме того, эта реакция протекает при специфической последовательности аминокислот в цепи Gly — X - Hyl, если X не является Pro или Hyp. Это указывает на то, что гликозилирование происходит до того, как про-α-цепи агрегируют. Следовательно, скорость формирования тройной спирали может определяться скоростью гликозилирования. In vitro гликозилирующий фермент из клеток сухожилия куриного эмбриона ингибируется кортизолацетатом [55].

Таблица 4.2. Процессы биосинтеза коллагена

Все четыре фермента, необходимые для внутриклеточной модификации про-α-цепей: пролил- и лизилгидроксилазы и галактозил- и глюкозилтрансферазы, у куриных эмбрионов имеют наибольшую активность в возрасте 14–16 сут [66]. Степень гидроксилирования лизиновых остатков в коллагене типов I и III мала, и, следовательно, в тканях, которые содержат этот коллаген, низок уровень галактозил- и глюкозилтрансферазы. В коллагене типов II и IV, который имеется в связках и в базальных мембранах соответственно, гидроксилирование лизина протекает активно, и уровень гликозилтрансфераз здесь также высок. Степень гликозилирования в коллагене разных тканей различна.

Секреция проколлагена

Тройная спираль проколлагена выделяется в межклеточный матрикс. В клетках фибробластов в культуре in vitro при ингибировании образования микротрубочек уменьшается выход проколлагена, а также его превращение в коллаген. Выход проколлагена из фибробластов уменьшается и при ингибировании гидроксилирования пролиновых остатков путем связывания Fe2+ в хелаты или путем инкубации клеток в анаэробных условиях. Добавление в среду инкубации аналогов пролина и лизина приводит к тому же результату. Считают, что скорость синтеза коллагена регулируется гидроксилированием пролиновых остатков, внутриклеточным пулом пролина и уровнем пролилгидроксилазы. Существует также несколько других контрольных пунктов — это трансляция на полисомах, агрегация цепей и их секреция. Нарушение процессов в любом из этих пунктов может замедлить синтез коллагена. Схема его синтеза выглядит следующим образом:

Внеклеточные процессы

Частичный протеолиз

Тройная спираль проколлагена после выхода в межклеточный матрикс подвергается частичному протеолизу и превращается в полностью сформированный мономер коллагена [85]. Две разные проколлагенпептидазы, обе внеклеточные, одна — специфическая для NH2-концевого пропептида, другая — для COOH-концевого пропептида, отщепляют от NH2- и COOH-концов соответственно неспиральные пропептиды [41, 51, 54]. Первым отщепляется NH2-пропептид, затем COOH-пропептид [13]. Пептидазы не являются сериновыми ферментами и не ингибируются SH-реагентами [25]. NH2-пептидазу выделили в чистом виде из кожи, сухожилия и связок крыс и костей кур. Она активна при нейтральном рН и не ингибируется n-хлормеркурибензоатом (nХМБ). Одиночные про-α-цепи также служат субстратом для этого фермента. Он расщепляет пептидные связи между X — Glu и X — Gin. Затем Glu и Gin на NH2-конце циклизуются в остатки пирролидонкарбоновой кислоты. Каждая полностью сформированная цепь в результате содержит ~1012 остатков и имеет мол. массу 95000. Девяносто пять процентов каждой цепи имеют в каждом третьем положении, за исключением небольших участков на NH2- и COOH-концах, глициновый остаток. Об изменениях проколлагенпептидазы с возрастом имеющиеся сведения скудны. Известно, лишь, что при наследственной болезни крупного рогатого скота — дерматозпараксизе (неэластичная кожа, слабые суставные связки), для которой характерна невыраженная бороздчатость коллагена, уровень фермента очень низок.

Модификация оксилизиновых остатков и образование поперечных сшивок

Гидронсилиорование пролиновых и лизиновых остатков происходит в клетке. Оксилизиновые остатки в α-цепях подвергаются дальнейшей химической модификации в межклеточном матриксе. Эти процессы играют важную роль в образовании ковалентных поперечных сшивок полипептидных цепей и формировании коллагеновых фибрилл. Известно, что при нарушениях в ходе модификаций меняется структура, а следовательно, и функции коллагена. О возрастных изменениях в реакциях модификации оксилизиновых остатков известно мало, имеется лишь некоторая информация о нарушениях при ряде заболеваний. При синдроме Элерса — Данлоса, для которого характерны потеря эластичности кожи и связочного аппарата с повторными вывихами суставов, обнаружено заметное уменьшение числа оксилизиновых остатков [59]. Коллаген кожи становится аномально растворимым в денатурирующих агентах, а количество лизилгидроксилазы значительно уменьшается то сравнению с нормой. Возможно, это связано с неправильным образованием поперечных сшивок, когда многие из оксилизиновых остатков становятся недоступными.

В коллагене обнаружены три основных типа поперечных сшивок [74, 76, 77, 79]. Они образуются после ферментативной модификации лизиновых остатков в альдегидную форму, аллизин, вне клетки с помощью фермента лизилоксидазы. Аллизин играет важную роль в возникновении сшивок. Поперечные сшивки можно идентифицировать путем их восстановления боргидридом натрия (NaBH4). Если использовать меченый тритием NaB3H4, тритий включается в поперечные сшивки, которые затем и определяют. Подобные исследования показали, что сшивки представляют собой альдимин (шиффово основание). Структура некоторых из них приведена ниже.

Схема 4.1

Лизилоксидаза — внеклеточный фермент, содержащийся в костях и других тканях, катализирует удаление NH2-групп лизиновых и оксилизиновых остатков в неспиральных NH2- и COOH-концевых участках и одновременно окисляет ε-углерод в CHO. При этом образуются δ-полуальдегид α-аминоадипиновой кислоты (аллизин) и δ-толуальдегид δ-окси-α-аминоадипи-новой кислоты соответственно. Поперечные сшивки образуют только δ-полуальдегид α-аминоадипиновой кислоты и δ-полуальдегид δ-окси-α-аминоадипиновой кислоты [77]. Фермент специфически дезаминирует лизиновые остатки полипептидной цепи, но не активен по отношению к свободному лизину. Он ингибируется β-аминопропионитрилом. В культуре клеток фибробластов in vitro поперечные сшивки в мономерах коллагена не возникают, если в среду добавлен β-аминопропионитрил или в ней недостаточно меди. Описанный дефект аналогичен наблюдаемому при латиризме.

Альдегидные группы легко вводятся в Lys9 α1-цепи и в Lys6 α2-цепи l[83]. Lys1044 в COOH-концевом участке (девятый от COOH-конца) также превращается в аллизин [65]. В COOH-концевом участке есть и оксилизиновые остатки, которые тоже вносят вклад в образование поперечных сшивок. Некоторые из наиболее типичных поперечных сшивок изображены на схеме 4.2.

Схема 4.2

Поперечные сшивки коллагена различны в разных тканях и в α-цепях разных типов [3]. Например, в связках, в которых проколлаген образуется только из α1(II) — цепей, поперечные сшивки представляют собой в основном дегидродиоксилизинонорлейцин (ДДОЛНЛ). Такие же сшивки есть в коллагене матки, состоящем из α1- и α2-цепей. Из цепей этих двух типов более предпочтительно сшиваются α2-цепи. Поэтому при фракционировании коллагена из таких тканей получают в основном димеры α2 и мономеры α1. Кроме того, оказалось, что природа поперечных сшивок зависит от степени гидроксилирования лизиновых остатков в NH2-концевом тело пептиде. В тканях типа костей и связок, в которых содержится наименее растворимый коллаген, образуется ДДОЛНЛ. В коллагене сухожилий, кожи и других тканей кроме ДДОЛНЛ имеются другие, более лабильные сшивки типа дегидроксинорлейцина (ДОНЛ), В образование межмолекулярных связей включается и фракция С, но в коллагене костей, связок и матки она практически отсутствует. Обнаружено, что в матке, коже и других мягких тканях она имеет в основном специальные функции.

Предложена модель превращения проколлагена в коллаген [14]. Цистеиновые остатки на COOH-конце про-α-цепи образуют S — S-связи, что способствует выстраиванию цепей в тройную спираль проколлагена в клетке. После секреции во внеклеточное пространство NH2-концевая протеаза удаляет NH2-концевые пропептиды. Затем с помощью COOH-концевой протеазы удаляются COOH-концевые пропептиды, при этом исчезают и участки, связанные S — S-связями, и образуется молекула коллагена. В коллагене нет COOH-концевых участков, связанных S — S-связями.

Изменения коллагена, связанные с возрастом

Отдельные цепи коллагена диссоциируют в щелочной или в кислой среде и в растворах мочевины, тиоцианата и гуанидин-гидрохлорида. При нагревании до 40 °C водородные связи между цепями рвутся. Количество коллагена, которое экстрагируется таким способом, велико у развивающихся животных, но быстро уменьшается с возрастом. Когда коллаген экстрагировали нейтральной солью из кожи крыс возрастом от. 1, 5 до 24 мес, было обнаружено, что у более старых животных экстрагируется меньше коллагена [36]. При этом количество экстрагирующихся одиночных α-цепей быстро уменьшалось, а тримеров α-цепей (γ-коллаген) — увеличивалось (рис. 4.3 и 4.4; табл. 4.3). Для димеров α-цепей (β-коллаген) изменений не наблюдалось.

Таблица 4.3. Соотношение различных типов коллагена из кожи крыс как функция возраста

Изучены изменения поперечных сшивок коллагена из бычьей кожи по мере развития животных [67]. В коже зародышей много сшивок типа ДДОЛНЛ, которые делают ее плохо растворимой. К рождению доля этих сшивок уменьшается примерно на одну треть. В возрасте 6 мес их практически нет, их заменяют диоксилизинонорлейцин (ДОЛНЛ) и фракция С. До 18 мес количество этих сшивок постепенно увеличивается и составляет около 95 % всех сшивок. В коже человека максимальное количество ДОЛНЛ и фракции С наблюдается в возрасте 17–20 лет.

В период развития коллаген постоянно обновляется. По-видимому, изменение характера поперечных сшивок и их соотношения в течение этого периода обусловлено появлением α-цепей различных типов. Обмен коллагена постепенно замедляется, так как развитие сопровождается уменьшением скорости синтеза и разрушением коллагена. Показано, что потребление в коже крыс аскорбиновой кислоты, которая является кофактором и пролил- и лизилгидроксилазы, велико при рождении и быстро уменьшается по мере развития животных. В возрасте 6 мес потребление аскорбиновой кислоты составляет одну сотую от ее потребления при рождении. Вместе с тем аскорбиновая кислота в течение всей жизни поглощается костями и связками, правда после 12 нед ее поглощение падает. Очевидно, синтез коллагена в коже крыс в возрасте 6–8 нед практически прекращается, тогда как в костях и связках он продолжается всю жизнь. Следовательно, аскорбиновая кислота требуется млекопитающим в течение всей жизни для поддержания нормального состояния костей и связок. Описанные результаты позволяют предположить, что появление в старческом возрасте морщин на коже может быть связано не только с прекращением обмена коллагена в ткани, но также с увеличением числа поперечных сшивок между мономерами коллагена, отложившегося в коже на ранних стадиях развития. Сообщают, что число сшивок в коллагене сухожилия хвоста крысы увеличивается в возрастном интервале 3-100 нед от 1 на 500000 до 1 на 50000, т. е. в 10 раз [93]. Это может изменить не только физические свойства коллагена, но и его способность экстрагироваться солевым раствором [32].

Другим фактором, влияющим на обмен коллагена в течение жизни животного, является фермент коллагеназа. Этот фермент расщепляет в коллагене связь Gly — Leu [31]. Паратгормон стимулирует синтез коллагеназы и вызывает деминерализацию костей. В матке в период беременности синтез фермента усиливается, тогда как прогестерон ингибирует его синтез [30]. В коже человеческого эмбриона коллагеназы больше, чем у взрослого человека. Если кожу эмбриона и взрослого человека культивировать in vitro, то из первой выделяется в среду значительное количество латентной, неактивной, коллагеназы (зимогена), однако из последней латентная коллагеназа не выделяется [72]. Молекулярная масса латентной коллагеназы из кожи человека — 55000-60000, а активной коллагеназы — 45000-50000 [75]. Если латентный фермент пропустить через колонку с сефадексом G-50, обработанным предварительно NaI, то он активируется. Трипсин удаляет из молекулы фермента пептид с мол. массой 10000 и активирует его. Таким образом, фермент, по-видимому, инактивируется путем связывания с ингибитором, имеющим мол. массу 10000. Комплекс фермент — ингибитор (латентная коллагеназа) активируется тиолблокирующими агентами, например 4-аминофенилмеркуриацетатом [70]. Природу ингибитора еще предстоит установить, однако ясно, что активность коллагеназы может быть еще одним контрольным пунктом обмена коллагена и изменения его структуры при старении.

Согласно одной из теорий старения, основанной на образовании поперечных сшивок [90], увеличение числа таких сшивок в коллагене и других внеклеточных макромолекулах вызывает изменение физических и химических свойств соединительных тканей. Свидетельством в пользу этой теории служит то, что экстрагируемость коллагена из кожи и его расщепление коллагеназой с возрастом уменьшаются, а его термостабильность и сила сокращения при этом увеличиваются. Даже если увеличение числа сшивок и вызывает эти изменения и оказывает влияние на функционирование соединительных тканей при старении животного, старение других тканей, не имеющих большого количества внеклеточного матрикса и коллагена, должно иметь другие причины. Кроме того, образование поперечных сшивок происходит после модификации, осуществляемой с помощью лизилоксидазы. Изменение содержания этого фермента в соединительных тканях с возрастом также может быть причиной увеличения числа сшивок.

В ряде работ [5, 9] сообщается, что количество поперечных сшивок в коллагене при старении растет. Однако более поздние исследования не подтверждают это заключение. Когда измеряли число сшивок в сухожилии коров 3- и 12-летнего возраста после расщепления коллагена цианогенбромидом, никакой разницы в количестве ковалентных сшивок не обнаружили [15]. При определении числа сшивок, образованных пиридинолином в коллагене реберных связок и ахиллесова сухожилия крыс и человека [50], было показано, что у человека после 30 лет оно уменьшается, а у крыс после наступления зрелости растет. Основные типы сшивок — оксилизинонорлейцин (ОЛНЛ) и диоксилизинонорлейцин (ДОЛНЛ) с возрастом не меняются [81], т. е. образование поперечных сшивок в коллагене не является, по-видимому, первичной причиной старения [46]. Было высказано предположение, что уменьшение растворимости коллагена с возрастом может определяться стабилизацией лабильных сшивок. Для того чтобы установить, меняется ли количество поперечных сшивок с возрастом, необходимы дальнейшие исследования.

Особый интерес в связи с этим представляют три типа реакций. Первый — это реакции моносахаридов, глюкозы и галактозы, с альдегидами, образовавшимися из лизиновых и оксилизиновых остатков. В коже быка интенсивность этих реакций с возрастом увеличивается. Поскольку упомянутые здесь гексозильные соединения не могут образовывать связи с другими α-цепями, в результате этих реакций уменьшается число потенциальных мест для образования сшивок. Роль происходящих изменений неясна, но, возможно, они ответственны за повышенную хрупкость кожи и костей в старческом возрасте.

Второй тип реакций — взаимодействие аллизина с оксилизином с образованием альдимина или взаимодействие оксиаллизина с оксилизином либо с лизином с образованием кетоаминов, более стабильных, чем альдимины. Доля таких поперечных сшивок в сухожилиях человека, быка и крысы в период их роста увеличивается, но затем уменьшается. Эти изменения могут регулироваться уровнем лизилгидроксилазы, который в свою очередь зависит от других факторов.

Третий тип реакций — определение сшивок путем восстановления 3Н-боргидридом. С возрастом количество включающегося трития уменьшается. Возможно, причиной этому служит уменьшение доли таких сшивок. Вместе с тем причиной уменьшения включения трития может быть то, что эти сшивки в старческом возрасте становятся более стабильными и поэтому не восстанавливаются.

В ранний период развития в тканях меняются не только число и стабильность поперечных сшивок, но также и типы коллагена. Как было показано ранее [19], в коже и, возможно, в других тканях изменяется соотношение коллагена типа I и III. Обычно в культуре in vitro хондроциты синтезируют коллаген типа II, но если их обработать бромдезоксиуридином, аналогом тимидина, то они синтезируют тип I и другой тип коллагена, которого в тканях в норме нет [45]. Коллаген типа I синтезируют также старые хондроциты. Если в связках обычно синтезируется коллаген типа II, то в связках суставов при остеоартрите появляется коллаген типа I [53]. Было бы существенно выяснить, по этой ли причине происходит уменьшение в старческом возрасте коллагенового матрикса при остеопорозе. Может ли произойти замена синтеза остеобластами коллагена типа I на синтез коллагена какого-либо другого типа? При врожденной болезни — osteogenesis imperfecta — при которой кости становятся очень хрупкими, фибробласты кожи в культуре синтезируют в большом количестве коллаген типа III. Некоторые связанные с коллагеном заболевания возникают из-за уменьшения уровня специфических ферментов, необходимых для его синтеза [42]. Происходит ли при этом сдвиг в синтезе или ингибирование синтеза коллагена типа I, неизвестно. Любое из этих изменений может повлиять на способность матрикса содействовать кристаллизации апатита, в результате чего кость может стать более хрупкой, так как известно, что все типы коллагена, кроме типа I, образуют аморфные волокна.

Структурные изменения коллагена при старении могут быть обусловлены несколькими факторами. Один из них, возможно, изменение в синтезе различных α-цепей, кодируемых разными генами. В таком случае интересно выяснить, что является причиной включения гена α-цепей одного типа и "выключения" гена α-цепей другого типа? Вместе с тем с возрастом может меняться активность пролил- и лизилгидроксилазы, лизилоксидазы и гликозилтрансфераз, влияющих на образование поперечных сшивок, и это также может отражаться на возрастных структурных изменениях. Хорошо известно, что уровень этих ферментов с возрастом меняется. Тогда что определяет уровень их синтеза? Одним из определяющих факторов может быть обмен коллагена, который зависит от активности коллагеназы. Коллагеназа, когда в ней нет необходимости, существует в неактивной форме. Синтез этого фермента, а также синтез его ингибитора и активация неактивной коллагеназы могут определяться различными факторами, уровень которых в свою очередь может меняться с возрастом.

Таким образом, можно предположить, что структурные изменения коллагена, зависящие от возраста, происходят из-за изменения уровня некоторых ферментов и, следовательно, являются вторичными причинами старения. Какое-либо повреждение первичных центров, т. е. генома, в результате которого может измениться синтез ферментов, принимающих участие в синтезе α-цепей, их деградации и модификации, может привести к нарушению структуры коллагена, а следовательно, и его функции. Отсюда вытекает необходимость изучения изменения в регуляции синтеза этих ферментов и разных типов α-цепей на уровне генома; только тогда можно разобраться в молекулярных событиях, связанных с изменениями в структуре коллагена как функции возраста. Полиморфизм молекул коллагена и сдвиги в соотношениях типов коллагена в тканях, наблюдающиеся на протяжении жизни, похожи на те явления, которые имеют место для изоферментов лактатдегидрогеназы [4] и аланинаминотрансферазы [56]. Все это может объясняться разной активностью генов, кодирующих свойства α-цепей разных типов. Активность генов может определяться факторами, уровень которых меняется на протяжении жизни. В пользу этой точки зрения свидетельствует тот факт, что синтез коллагена в период постэмбрионального развития свободно живущей нематоды Panagrellus silusiae имеет прерывистый характер, и каждая очередная его вспышка совпадает с увеличением уровня пролилгидроксилазы [43].

Замедление связанных с возрастом изменении в коллагене

Некоторые исследователи делали попытки замедлить возрастные изменения в коллагене с помощью гормонов. Так, введение гормона роста, пептида из передней доли гипофиза, стимулирует пролиферацию фибробластов, образование соединительной ткани и синтез коллагена. При гипофизэктомии не только замедляется рост крыс, но уменьшается содержание коллагена и тормозится его синтез в различных тканях [17]. Значительно замедляются также превращение лизина в полуальдегид α-аминоадипиновой кислоты и полимеризация коллагена [73]. Оказалось также, что после гипофизэктомии уменьшается синтез лизилаксидазы.

Другие гормоны — тироксин, АКТГ, кортикостероиды и половые гормоны — оказывают влияние на метаболизм коллагена. У гипотиреоидных крыс содержание коллагена уменьшается, а введение тироксина его нормализует [17]. Катаболизм коллагена сильно уменьшается и при гипертироидизме, и при гипотироидизме. Кортикостероиды в основном ингибируют синтез коллагена. Аналогичным образом влияет АКТГ. Тестостерон усиливает синтез коллагена. У кастрированных самцов крыс синтез коллагена в коже уменьшается, а доля нерастворимого коллагена увеличивается. Эффект эстрогена на метаболизм коллагена неясен. Механизм действия всех этих гормонов еще необходимо установить. При этом следует учесть, что очень важно правильно дозировать вводимый гормон: нефизиологические дозы могут вызвать различные побочные эффекты и привести к ошибочным результатам.

Для изучения влияния гормонов на молекулярную структуру коллагена либо удаляли специфические эндокринные железы, либо вводили гормоны. Синтез коллагена и других белков после гипофизэктомии замедляется. Спустя три недели после этой операции в сухожилии хвоста крыс сильно уменьшается доля α-цепей (рис. 4.10). Кроме того, вообще уменьшается количество вновь синтезируемого коллагена, а его физические свойства становятся похожими на свойства коллагена у старых крыс, т. е. растворимость коллагена понижается, точка разрыва повышается, а развивающееся напряжение увеличивается. Однако коллаген, экстрагированный из тканей крыс значительно позже, имеет свойства, подобные коллагену молодых крыс. Крысы, у которых гипофиз был удален в возрасте 800 сут, имели волокна коллагена с такой же растворимостью (рис. 4.2) и такими другими физическими свойствами, какие наблюдаются у крыс 400-дневного возраста. Гипофизэктомия замедляет также старение коллагена кожи крыс [91]. Полагают, что после удаления гипофиза замедляется превращение лабильных поперечных сшивок в стабильные, но как это происходит, неизвестно. Данное предположение подтверждается тем фактом, что у крыс, лишенных гипофиза, лизилоксидаза не определяется, но ее активность приближается к норме, если крысы получают гормон роста и кортизон [38]. При гипофизэктомии, однако, уменьшается продолжительность жизни крыс. Так как крысы после операции едят меньше, чем в норме, можно предположить, что замедление старения их коллагена связано с более низким потреблением пищи. Однако, когда сравнивают коллаген этих крыс с коллагеном интактных животных, получавших такие же количества пищи, оказывается, что старение замедляется у первых гораздо сильнее. Следовательно, гипофиз играет определенную роль в старении коллагена.

Рис. 4.10. Уменьшение количества α-субъединиц во вновь синтезируемом коллагене 25 дней спустя после гипофизэктомии, свидетельствующее об уменьшении синтеза коллагена [20]

Тироидэктомия, как и гипофизэктомия, сначала ускоряет старение коллагена, а позже — замедляет. Начальный эффект может заключаться в понижении синтеза коллагена. Если крысам, подвергнутым тироидэктомии, дают тироксин, то коллаген стареет, причем это происходит только тогда, когда возрастает потребление пищи. Эстроген стимулирует активизацию лизилоксидазы и ускоряет созревание коллагена. Он способствует увеличению содержания коллагена в костях и в матке [69].

Эти исследования показывают, что на возрастные структурные изменения, или старение, коллагена оказывают влияние гормоны, и, следовательно, эти изменения являются вторичными причинами старения. В разные периоды жизни уровень гормонов меняется, а это может приводить к изменению физических свойств коллагена.

Резюме

Коллаген — это структурный белок, содержащийся в тканях животных в больших количествах и легко экстрагируемый. Поэтому ряд исследователей изучали его свойства в зависимости от возраста. Структура коллагена представляет собой фибриллы, состоящие из мономеров. Каждый мономер — это тройная спираль из трех полипептидных цепей. Существует два типа цепей — α1 и α2, поэтому коллагену присущ молекулярный полиморфизм. Имеется четыре варианта цепей типа α1. Цепь каждого типа кодируется специфическим геном. В тканях обнаружен коллаген четырех основных типов, которые определяются тем, из каких a-цепей сформированы тройные спирали: коллагены типа I, II, III и IV, имеющие строение соответственно [α1(I)]2α2, [α1(II)]3, [α1(III)]3 и [α1(IV)]3. В разных тканях синтезируются разные цепи коллагена в разных соотношениях, причем эти соотношения меняются по мере развития животного.

В полисоме синтезируются про-α-цепи. Пролиновые и лизиновые остатки гидроксилируются соответствующими гидроксилазами в ходе и после окончания образования цепи. Гликозилтрансферазы гликозилируют оксилизиновые остатки в клетке. Связыванию друг с другом трех α-цепей способствуют S — S-связи, которые образуются цистеиновыми остатками, имеющимися в COOH-концевом участке. Это связывание происходит в шероховатом эндоплазм этическом ретикулуме; в результате образуется тройная спираль мономера проколлагена, которая затем выделяется в межклеточный матрикс. Две разные проколлагенпептидазы удаляют пропептидные фрагменты с NH2-и COOH-концов проколлагена. Лизиновые остатки окислительно дезаминируются при участии лизилоксидазы. В результате появляется аллизин, который образует поперечные сшивки, взаимодействуя с лизиновым или аллизиновым остатками α-цепи того же или соседнего мономера. Таким образом возникают фибриллы коллагена. Содержание ферментов, ответственных за эти модификации, на протяжении жизни животного меняется. Изменение содержания ферментов может быть причиной возрастных структурных изменений коллагена. Итак, по-видимому, связанные с возрастом структурные изменения коллагена обусловлены изменениями активности ферментов, необходимых для его структурной модификации, и, следовательно, являются вторичными причинами старения.

Литература

1. Anttinen H., Myllyla R., Kivirikko K. I. Biochem. J., 175, 737–742 (1978).

2. Anttinen H., Oikarinen A., Kivirikko K. I. Clin. Chim. Acta, 76, 95-101 (1977).

3. Bailey A. J., Robins S. P. In: Frontiers of Matrix Biology, Vol. I, p. 130 (L. Robert and B. Robert, Eds.), S. Karger, Basel (1973).

4. Bailey A. J., Robins S. P. Science Prog., 63, 419–444 (1976),

5. Bailey A. J., Robins S. P., Balian G. Nature, 251, 105–109 (1974).

6. Barnes M. J., Constable B. J., Morton L. F., Kodicek E. Biochem. J., 125, 925–928 (1971).

7. Barnes M. J., Constable B. L, Morton L. F., Royce P. M. Biochem. J., 139, 461–468 (1974).

8. Bates C. H., Bailey A. J., Prynne С J., Levene C. I. Biochim. Biophys. Acta, 278, 372–390 (1972).

9. Bjorksten J. In: Protein Crosslinking, Nutritional and Medical Consequences (M. Friedman, Ed.), 579–602, Plenum Press, New York (1977).

10. Bornstein P. Ann. Rev. Biochem., 43, 567–603 (1974).

11. Bornstein P. Mech. Age. Dev., 5, 305–314 (1976).

12. Clark C. C., Kefalides N. A. Proc. nat. Acad. Sci. USA, 73, 34–38 (1976).

13. Davidson J. M., McEneany L. S. G., Bornstein P. Biochemistry, 14, 5188–5194 (1976).

14. Davidson J. M., McEneany L. S. G., Bornstein P. Europ. J. Biochem., 81, 349–355 (1977).

15. Davidson P. F. J. biol. Chem., 253, 5635–5641 (1978).

16. Delbridge L., Everitt A. V. Gerontologia, 18, 169–175 (1972).

17. Deyl Z., Rosmus J., Adam M. In: Hypothalamus, Pituitary and Aging (A. V. Everitt and J. A. Burgess, Eds.), 171–192, Charles C. Thomas, Springfield (1976).

18. Diaz L., deLeon L., Stern R. Biochem. Biophys. Res. Commun, 77, 11–19 (1977).

19. Epstein E. H. J. biol. Chem., 249, 3225–3231 (1974).

20. Everitt A. V., Delbridge L. Expl. Gerontol., 7, 45–51 (1972).

21. Everitt A. V., Delbridge L. In: Hypothalamus, Pituitary and Ageing (A. V. Everitt and J. A. Burgess, Eds.), 193–208, Charles С Thomas, Springfield (1976).

22. Everitt A. V., Olsen G. G., Burrows G. R. J. Gerontol., 23, 333-^336 (1968).

23. Eyre D. R., Muir H. Biochim. Biophys. Acta, 492, 29–42 (1977).

24. Fessler J. H., Fessler L. I. Ann. Rev. Biochem., 47, 129–162 (1978).

25. Fessler L. I., Morris N. P., Fessler J. H. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 72, 4905–4909 (1975).

26. Frischauf A. M., Lehrach H., Rosner C., Boedtker H. Biochemistry, 17, 3243–3248 (1978).

27. Gallop P. M., Blumenfeld O. O., Seifter S. Ann. Rev. Biochem., 41, 617–672 (1972).

28. Gallop P. M., Paz M. Physiol. Rev., 55, 418–487 (1975).

29. Gross J. In: The Harvey Lectures, 1972–1973, pp. 351–432, Academic Press, New York and London (1972–1973).

30. Gross J. In: Biochemistry of Collagen (G. N. Ramachandran and A. H. Reddi, Eds.), 275–317, Plenum Press, New York (1976).

31. Gross J., Harper E., Harris E. D., McCroskery P. A., Highberger J. H., Corbett C., Kang A. H. Biochem. Biophys. Res. Commun., 61, 605–612 (1974).

32. Hall D. A. Ageing of Connective Tissue, Academic Press, London and New York (1976).

33. Hamlin C. R., Kohn R. R. Expl. Gerontol., 7, 377–379 (1972).

34. Haralson M. A., Sonneborn J. H., Mitchell W. M. J. biol. Chem., 253, 5536–5542 (1978).

35. Harwood R., Grant M. E., Jackson D. S. Biochem. Soc. Trans., 3, 916–917 (1975).

36. Heikkinen E., Kulonen E. Experientia, 20, 310 (1964).

37. Hofmann H., Fietzek P. P., Kühn K. J. molec. Biol., 125, 137–165 (1978).

38. Howarth D., Everitt A. V. Gerontologia, 20, 27–32 (1974).

39. Kanungo M. S., Patnaik B. K. Biochem. J., 90, 637–640 (1964).

40. Kivirikko K. I., Prockop D. J. Arch. Biochem. Biophys., 118, 611–618 (1967).

41. Lapiere C. M., Lanaers A., Kohn L. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 68, 3054–3058 (1971).

42. Lapiere C. M., Nusgens B. In: Biochemistry of Collagen (G. N. Ramachandran and A. H. Reddi, Eds.), 377–447, Plenum Press, New York (1976).

43. Leushner J., Pasternak J. Devi. Biol., 47, 68–80 (1975).

44. Mackert C. L., Möller F. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 45, 753–762 (1959).

45. Mayne R., Vail M. S., Miller E. J. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 72, 4511 — 4515 (1975).

46. McClain P. E. In: Protein Cross-linking, Nutritional and Medical Consequences (M. Friedman, Ed.), 603–618, Plenum Press, New York (1977).

47. Miller A. In: Biochemistry of Collagen (G. N. Ramachandran and A. H. Reddi, Eds.), 85-136, Plenum Press, New York (1976).

48. Miller R. L. Arch. Biochem. Biophys., 147, 339–342 (1971).

49. Morgan P. H., Jacobs H. G., Segrest J. P., Cunningham L. W. J. biol. Chem., 245, 5042–5048 (1970).

50. Moriguchi T., Fujumoto D. J. Biochem., 84, 933–935 (1978).

51. Morris N. P., Fessler L. I., Weinstock A., Fessler J. H. J. biol. Chem., 250, 5719–5726 (1975).

52. Myllyla R., Savolainen E. R. K., Kivirikko K. I. Biochem. Biophys. Res. Commun., 83, 441–448 (1978).

53. Nimmi M., Deshmukh K. Science, 181, 751–752 (1973).

54. Nist C., Vandermark K., Hay E. D., Olsen B. R., Bornstein P., Ross R., Dehm P. J. Cell. Biol., 65, 75–87 (1975).

55. Oikarinen A. Biochem. J., 164, 533–539 (1977).

56. Patnaik S. K., Kanungo M. S. Ind. J. Biochem. Biophys., 13, 117–124 (1976).

57. Piez K. A. In: Biochemistry of Collagen (G. N. Ramachandran and A. H. Reddi, Eds.), 1-44, Plenum Press, New York (1976).

58. Piez K. A., Trus B. L. J. molec. Biol., 122, 419–432 (1978).

59. Pinnell S. R., Krane S. M., Kenzora J. E., Glimcher M. J. New Eng. J. Med., 286, 1013–1020 (1972).

60. Prockop D. J., Berg R. A., Kivirikko K. I., Uitta J. In: Biochemistry of Collagen (G. N. Ramachandran and A. H. Reddi, Eds.), 163–273, Plenum Press, New York (1976).

61. Raj C. V. S., Church R. L., Creagan R. P., Ruddle F. H. J. Cell. Biol., 70 A78 (1976).

62. Ramachandran G. N., Reddi A. H. (Eds.). Biochemistry of Collagen, Plenum Press, New York (1976).

63. Ramachandran G. N., Ramakrishnan C. In: Biochemistry of Collagen (G. N. Ramachandran and A. H. Reddi, Eds.), 45–84, Plenum Press, New York (1976).

64. Rao N. W., Adams E. J. biol. Chem, 253, 6327–6330 (1978).

65. Rauterberg J., Timpl R., Furthmayer H. Europ. J. Biochem, 27, 231–237

66. Risteli L. Biochim. Biophys. Acta, 497, 673–681 (1977).

67. Robins S. P., Shimokomaki M., Bailey A. J. Biochem. J., 131. 771–780 (1973).

68. Rosenbloom J., Endo R., Harsch M. J. biol. Chem, 251, 2070–2076 (1976)

69. Sanada H., Shikata J., Hamamoto H., Uoba V., Yamamura T., Taked T. Biochim. Biophys. Acta, 541, 408–413 (1978).

70. Sellers A., Cartwright E., Murphy G., Reynold J. J. Biochem. J., 163, 303–307 (1977).

71. Seyer J. M., Kang A. H., Whitaker J. W. Biochim. Biophys. Acta, 492, 415–425 (1977).

72. Shinkai H., Nagai Y. J. Biochem., 81, 1261 (1977).

73. Shosan S., Finkelstein S., Kushner W., Weinreb M. M. Connective Tissue Res, 1,47 (1972).

74. Stimler N. P., Tanzer M. L. In: Protein Gros-Ionking: Nutritional and Medial Consequences (M. Friedman, ed.), 675–697, Plenum Press, New York

75. Stricklin G. P., Eisen A. Z., Bauer E. A., Jeffrey J. J. Biochemistry 17 2331–2337 (1978).

76. Tanzer M. L. Science, 180, 561–566 (1973).

77. Tanker M. L. In: Biochemistry of Collagen (G. N. Ramachandran and A. H. Reddi, Eds.), 137–162, Plenum Press, New York (1976).

78. Tanzer M. Z. Trends. Biochem. Sci, 3, 15–17 (1978).

79. Tanzer M L., Houslev T., Berube L., Fair weather R., Franzblau C., Gallop P. M. J. biol. Chem, 248, 393–402 (1973).

80. Toole B. P., Kang A. H., Trelstad R. L., Gross J. Biochem. J., 127, 715–720 (1972).

81. Torres A. R. Gerontology, 24, 337–342 (1978).

82. Traub W. FEBS Lett., 92, 114–120 (1978).

83. Traub W., Piez K. A. Adv. Prot. Chem., 25, 243–352 (1971).

84. Tryggvason K., Majamaa K., Kivirikko K. I. Biochem J., 178 127–131 (1979).

85. Tuderman L., Kivirikko K. I., Prockop D. J. Biochemistry, 17, 2948–2954 (1978).

86. Tuderman L., Myllyla R., Kivirikko K. I. Europ. J. Biochem., 80, 341–348 (1977).

87. Verzar F. Experientia, 11, 230 (1955).

88. Verzar F. Acta Anat., 33, 215–229 (1958).

89. Verzar F. Sci. Amer., 208, 104–114 (1963).

90. Verzar F. Int. Rev. Connect. Tissue Res., 2, 243 (1964).

91. Verzar F., Spichtin H. Gerontologia, 12, 48–56 (1966).

92. Verzar F., Thoenen H. Gerontologia, 4, 112–119 (1960).

93. Vihersaari T., Heikkinen E. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 27, Suppl. 116, (1969).

94. Williams B. R., Gelman R. A., Poppke D. C, Prez K. A. J. biol. Chem., 253, 5678–5685 (1978).

Глава 5. Изменения в гормональной системе

Введение

Гормоны — это вещества, которые синтезируются в эндокринных органах и секретируются в кровь. Их действие проявляется в тканях-мишенях, в которых они модулируют различные метаболические и другие процессы. Гормоны можно разделить на три группы: а) стероиды гонад и коры надпочечника (рис. 5.1); б) производные аминокислот из щитовидной железы и мозгового вещества надпочечника (рис. 5.2); в) пептиды гипоталамуса, гипофиза, щитовидной железы, паращитовидной железы и островков Лангерганса поджелудочной железы (рис. 5.3). Спектр действия гормонов весьма широк. Они влияют на репликацию ДНК, транскрипцию и трансляцию, деление и рост клеток, уровень ферментов и гомеостатическую регуляцию метаболитов. Кроме того, они воздействуют на свойства и развитие половых качеств. На рис. 5.4 показана взаимосвязь между эндокринными органами и тканями-мишенями. Гормоны гипофиза контролируют синтез гормонов и их секрецию из некоторых других эндокринных органов. Секреция гормонов из гипофиза в свою очередь контролируется пептидами гипоталамуса. Для регуляции уровня гормонов в крови существуют механизмы обратной связи между гипоталамусом, гипофизом и другими эндокринными органами.

Рис. 5.1. Структура некоторых стероидных гормонов — производных холестерина

Рис. 5.2. Структура гормонов — производных аминокислот

Рис. 5.3. Структура некоторых пептидных гормонов

Рис. 5.4. Взаимосвязь между эндокринными органами и тканями-мишенями [60]

Гормоны оказывают свое действие на органы-мишени двумя путями. Действие стероидных гормонов проявляется на уровне генов (рис. 5.5). Эти гормоны растворяются в липидах и поэтому проникают через клеточные мембраны клеток-мишеней. Затем они связываются с молекулами специфических белков-рецепторов, находящихся в цитозоле клетки, в результате чего образуется комплекс гормон — рецептор (Г-Р). Этот комплекс переходит в ядро и связывается со специфическими акцепторными центрами хроматина. Это приводит к стимуляции транскрипции определенных типов мРНК и последующему усилению синтеза специфических белков.

Рис. 5.5. Механизм действия стероидных гормонов

Пептидные гормоны и производные аминокислот обычно не способны проникать сквозь мембраны, и соответствующие им рецепторы расположены на клеточных мембранах клеток-мишеней. Связывание гормонов с мембранными рецепторами вызывает стимуляцию связанной с мембраной аденилатциклазы. Это в свою очередь приводит к увеличению в цитоплазме количества сАМР, активирующего некоторые ферменты, в результате чего усиливается или ослабляется какая-либо функция организма (рис. 5.6). Как показано, пептидные гормоны стимулируют транскрипцию, что, по-видимому, является их опосредованным действием [19].

Рис. 5.6. Механизм действия адреналина (пептидных гормонов). R — регуляторные субъединицы протеинкиназы; C — каталитические субъединицы протеинкиназы (PK)

Гормоны оказывают влияние на разных уровнях. Поскольку некоторые гормоны синтезируются только в определенные периоды жизненного цикла, их действие проявляется в основном в эти периоды. Изменения в их синтезе и содержании после достижения половой зрелости могут приводить к нарушениям функций организма. Действие гормонов может быть ослаблено из-за изменений на любой из следующих стадий:

1. Синтез гормонов: он зависит от одного или нескольких ферментов, и изменения в их синтезе и содержании, возможно, влияют на синтез гормонов.

2. Процессинг гормонов: многие гормоны, особенно пептиды, синтезируются в виде неактивных предшественников, а затем превращаются в активные гормоны. Для этого необходимы ферменты, а их содержание, возможно, меняется с возрастом.

3. Транспорт гормонов к тканям-мишеням: многие гормоны переносятся потоком крови будучи связанными с крупными молекулами белков, и изменение количества этих белков может нарушить доставку гормонов в ткани-мишени.

4. Содержание и сродство рецепторов в мембране или в цитозоле (в зависимости от типа гормона) могут меняться и изменять действие гормона. Рецепторы гормонов — это белки, и их синтез, как синтез всякого белка, по-видимому, меняется с возрастом.

5. Комплекс Г-Р в случае стероидных гормонов может не проникать в ядро из-за изменений в проницаемости ядерной мембраны.

6. Комплекс Г-Р после проникновения в ядро может не связываться в достаточной степени с хроматином из-за изменений его конформации или акцепторных центров.

7. Популяция клеток в ткани мишени может измениться, и в результате этого может измениться ответ на действие гормонов. Если ткань содержит гетерогенную популяцию клеток, как, например, мозг и печень, с возрастом может изменяться соотношение равных клеток. Может происходить гибель клеток, как это наблюдается для нейронов и мышечных клеток. В тех тканях, в которых клетки делятся на протяжении всей жизни (например, в печени, костном мозгу и эпителиальной ткани), с возрастом может изменяться скорость деления, а также соотношение клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла.

8. С возрастом может меняться проницаемость клеточных и (или) ядерных мембран, что приводит к изменению способности гормона проникать в клетку.

Опубликован ряд обзоров, посвященных некоторым проблемам, связанным с изменением действия гормонов с возрастом [1, 2, 6, 23, 26, 51–53]. Внимание исследователей, занимающихся этими проблемами, привлекают следующие направления: а) измерение содержания гормонов в крови; б) измерение количества рецепторов различных гормонов в тканях-мишенях; в) ответ тканей-мишеней на действие специфических гормонов. Каждый из этих параметров зависит от одного или многих факторов. Например, изменение содержания гормона, циркулирующего в крови, может быть вызвано изменением либо его обмена, процессинга или секреции, либо содержания сывороточного белка, с которым связан гормон. Аналогичным образом изменение уровня белка-рецептора может определяться транскрипцией специфического гена, трансляцией соответствующей мРНК и факторами, которые стимулируют или ингибируют эти: процессы. Кроме того, присутствие эффекторов, вероятно, связывающихся с белком, может в свою очередь повлиять на его связывание с гормоном. В разные периоды жизни ответ ткани или клетки на действие эндогенного или введение экзогенного гормона может быть различным. Причиной могут служить различные факторы, например изменения в транспорте и доставке гормона в ткани-мишени, изменения в содержании белка-рецептора, изменения в хроматине или изменения в процессах транскрипции и трансляции. Основная функция гормона — вызвать ответ ткани в нужный момент времени, но, как следует из предыдущего рассмотрения, она зависит от нескольких взаимодействующих между собой факторов.

Содержание гормонов

В табл. 5.1 охарактеризованы изменения содержания различных гормонов в крови млекопитающих в старческом возрасте. Установлено, в частности, что уровень стероидных гормонов падает. Два из них — эстроген и тестостерон — не только ответственны за появление репродуктивной способности, но и необходимы для сохранения этой способности и соответствующих половых качеств. Если в старческом возрасте их содержание падает, то можно ожидать, что уменьшается способность к воспроизведению и изменяются связанные с ней качества. Возникает вопрос: почему уровень этих гормонов падает? Происходит ли это из-за уменьшения количества ферментов, необходимых для их синтеза в гонадах, или из-за уменьшения количества тронных гормонов в гипофизе? Глюкокортикоиды из коры надпочечника необходимы для метаболизма углеводов и белков, и уменьшение их количества в старческом возрасте может привести к нарушению метаболизма.

Таблица 5.1. Содержание гормонов и их рецепторов и уровень ответа тканей-мишеней в старческом возрасте по сравнению со средним возрастом

1) Большая часть данных, за исключением указанных, взята из работ [26, 53].

2) ↑ увеличение; ↓ уменьшение; ←→ изменений нет.

Содержание изученных до сих пор многочисленных пептидных гормонов к старости, по-видимому, не меняется (табл. 5.2), хотя и претерпевает изменения в ранний период жизни. Например, показано, что у крыс уровень эндорфина быстро растет в возрасте от 5-й до 10-й нед, а затем остается постоянным до 25 нед [7]. Затем он уменьшается и вскоре достигает плато, причем его величина для крыс среднего и старшего возраста одна и та же. Значение изменений в количестве эндорфина в ранний период жизни еще подлежит уточнению. У карликовых мышей, живущих очень мало (средняя продолжительность их жизни составляет 4–5 мес), в отличие от нормальных мышей гормон роста и пролактин не синтезируются [56]. Это может быть причиной замедленного роста мышей, но, каким образом укорачивается продолжительность их жизни, неизвестно. Карликовые мыши являются мутантами, и отсутствие у них синтеза пептидных гормонов может объясняться одним или несколькими повреждениями гипофиза. Обычно количество большинства пептидных гормонов по окончании репродуктивного периода не меняется.

Таблица 5.2. Содержание гормонов и их рецепторов и уровень ответа тканей-мишеней в старческом возрасте по сравнению со средним возрастом1

1) Данные взяты из работ [6, 23, 26, 53].

2) ↑ увеличение; ↓ уменьшение; ←→ без изменений.

3) АЦ — аденилатциклаза.

Для некоторых стероидных и пептидных гормонов обнаружены циркадные ритмы в их содержании. Поэтому для измерения их количества существенно время, в которое отбирают пробы крови. Как было показано для некоторых ферментов, сами ритмы с возрастом меняются (рис. 5.7) [38]. На уровень гормонов в крови оказывают влияние некоторые процессы обратной связи, инициируемые в гипоталамусе, а они в свою очередь могут зависеть от ряда внешних факторов. Ответ гипоталамуса на их действие может изменяться с возрастом, и при этом меняется содержание гормонов. Следует иметь в виду еще одно важное обстоятельство: некоторые измерения содержания гормонов в крови проводили с помощью недостаточно чувствительных методов, поэтому данные об их количестве противоречивы.

Рис. 5.7. Активность ацетилхолинэстеразы из мозга незрелых и зрелых крыс.

I — крысы в возрасте 7 нед; II — 35 нед [38]

Содержание рецепторов гормонов

Из табл. 5.1 и 5.2 видно, что содержание рецепторов большинства гормонов, будь то стероидные или пептидные гормоны, в старческом возрасте падает. Сродство рецепторов к соответствующим гормонам измеряли лишь в нескольких случаях. Уменьшение количества белка-рецептора может быть обусловлено либо уменьшением транскрипции его гена, либо уменьшением трансляции его мРНК, либо большей степенью деградации самого рецептора. Способность хроматина из яйцевода цыплят связывать рецепторы прогестерона в ходе развития меняется [59]. Было показано, что введение прогестерона индуцирует синтез его рецептора. Таким образом, концентрация рецепторов в клетках-мишенях может определяться уровнем гормонов. Низкое содержание эстрогена в крови старых крыс-самок хорошо согласуется с низким содержанием его рецептора в мозгу [30]. Это означает, что клетки-мишени первоначальна могут содержать небольшое количество молекул рецепторов, которые стимулируют свой собственный синтез. Связывание небольшого числа молекул рецепторов с гормонами, возможно, стимулирует транскрипцию мРНК этих рецепторов, что приводит к синтезу нового количества рецепторов. Это может оказаться необходимым, если на какой-либо специфической стадии жизни повысится содержание какого-либо гормона.

В ряде работ было измерено содержание рецепторов стероидных гормонов в некоторых тканях. Эти гормоны индуцируют синтез ряда ферментов у молодых животных, но не индуцируют у старых. Одной из причин нарушения индукции может являться уменьшение уровня рецепторов. Кроме того, было установлено, что сила ответа ткани на действие стероидного гормона прямо пропорциональна количеству стероида, связанного с рецептором [5, 8, 19, 54]. Оказалось, что содержание ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в полушариях головного мозга после овариэктомии уменьшается у молодых и взрослых крыс, но не меняется у старых животных (80 нед). При введении этим крысам 17β-эстрадиола в количестве 10 мкг на 100 г веса тела содержание фермента возрастало у молодых крыс вдвое, а у взрослых в меньшей степени. У старых животных индукции фермента не наблюдалось [38]. Содержание рецептора 17β-эстрадиола измеряли путем инкубации 3Н-эстрадиола с цитозолем из мозгового полушария крыс-самок разного возраста. Было обнаружено, что сродство рецептора к гормону в старом возрасте значительно снижается (рис. 5.8) [30].

Рис. 5.8. Полученный с помощью хроматографии на сефадексе G-25-80 профиль элюции меченого белка (комплекс 3Н-эстрадиол — белок) (I) и всего белка (II). Цитозоль полушария мозга крыс в возрасте 7 нед после овариэктомии (А), 44 нед (Б) и 108 нед (В) [30]

Причиной уменьшения синтеза специфических белков-рецепторов может быть снижение в старческом возрасте содержания 17β-эстрадиола. В таком случае, можно ли увеличить содержание рецептора эстрадиола у старых крыс путем введения им гормона в количестве, равном его содержанию у животных среднего возраста? Если это возможно, то восстановятся ли при этом эстрадиол-зависимые функции, которые нарушаются в старческом возрасте?

Глюкокортикоиды включены в метаболизм углеводов и белков. Они индуцируют некоторые ферменты. Содержание белка, обладающего высоким сродством к гидрокортизону, в скелетных мышцах, полушариях мозга, предстательной железе и жировой подушечке придатка семенника у крыс уменьшается по окончании репродуктивного периода жизни вплоть до 25 мес [50]. В печени таких изменений не наблюдается, хотя известно, что в печени человека в старости уровень рецепторов падает [58]. Сообщалось, что уровень связывающих глюкокортикоиды белков в нейронах коры головного мозга крыс в возрасте 24–26 мес на 55–65 % ниже, чем у 12-13-месячных крыс. Удаление надпочечника не ведет к изменению содержания белков-рецепторов [51].

Важным фактором, который вносит вклад в ответ ткани на стероидные гормоны, может быть способность комплекса Г-Р проникать в ядро через ядерную мембрану. Сообщалось, что у старых крыс способность комплексов рецепторов с андрогенами и глюкокортикоидами проникать в ядро в клетках предстательной железы [55] и печени [37] понижена. Это связано, по-видимому, не только со структурными изменениями в ядерной мембране, но и с числом акцепторных центров хроматина, которое может меняться из-за конформационных изменений, являющихся функцией возраста. Нет сомнения, что при уменьшении степени проникновения комплекса Г-Р в ядро или его связывания с хроматином должна понижаться эффективность стимулирования транскрипции специфических генов.

Некоторые исследователи изучали содержание и сродство мембранных рецепторов к соответствующим гормонам как функцию возраста. Активность аденилатциклазы, стимулированная адреналином (но не глюкагоном), в мембране клеток печени крыс в ходе развития уменьшается [11]. В адипоцитах уменьшается активность аденилатциклазы, чувствительной к глюкагону [34]. В коре головного мозга наблюдается падение с возрастом определяемого норадреналином содержания сАМР [10]. Это проявляется в уменьшении активности аденилатциклазы [62]. Кроме того, с возрастом уменьшается чувствительность клеток коры головного мозга к норадреналину и дофамину [43, 62]. Адренергическое связывание в клетках мозжечка крыс и человека с возрастом также снижается [33]. Таким образом, дисфункция мозжечка в старческом возрасте может быть обусловлена утрачиванием нейронов, получающих норадренергический импульс. У старых людей концентрация β-адренергических мембранных рецепторов в лейкоцитах значительно ниже, чем в среднем возрасте, хотя сродство рецепторов к (-) 3Н-дигидроальпренелолу с возрастом не меняется [57]. Было обнаружено [18] дифференцированное (падение при старении активности аденилатциклазы, стимулированной норадреналином, глюкагоном и АКТГ. Неизвестно, вызвано ли это изменением рецепторов гормонов или самой аденилатциклазы. Связывание (-) 3Н-дигидроальпренелола и гамма-ашшомасляной кислоты с синаптическими мембранами в некоторых участках мозга с возрастом уменьшается [42]. Связывание 3Н-атропина с синаптосомами из коры головного мозга старых крыс значительно ниже, чем у более молодых животных (рис. 5.9) [28]. Следовательно, по окончании репродуктивного периода уменьшается содержание в мозгу мускариновых рецепторов ацетилхолина.

Рис. 5.9. Специфическое связывание 3Н-атропина с синаптосомальными фракциями (светлые столбики) и гидролиз ацетилтиохолина (темные столбики) в коре большого мозга и коре мозжечка у крыс-самок (А) и самцов (Б) разного возраста [28]

Приведенные выше данные, очевидно, достаточно сложны, так как они отражают различные взаимодействующие процессы. Кроме того, как и в случае ферментов, разные исследователи выражали содержание рецепторов разными способами. Уровень рецептора может зависеть от физиологических условий эксперимента. Некоторые использовали для определения содержания рецепторов гомогенат целиком, тогда как другие — его отдельные фракции. Оптимальная активность рецептора может быть обусловлена присутствием некоторых факторов, свойственных цитозолю, которые могут отсутствовать в отдельных фракциях. Кроме того, по всей вероятности, с возрастом меняется структура самих мембран, что влияет на центры взаимодействия с гормонами в молекулах рецептора.

Среди результатов, связанных с изменениями мембранных рецепторов, наблюдались, однако, некоторые исключения. Так, содержание рецепторов инсулина в печени [25], β-адренергических рецепторов в эритроцитах [13], рецепторов глюкагона в адипоцитах уменьшается в ранний период развития, а не по окончании репродуктивного периода. Очевидно, поддержание уровня этих рецепторов связано с определенными функциями, и эти функции не нарушены. Следует напомнить, что для начала процесса старения не обязательно ухудшение или нарушение всех функций организма. Кроме того, изменение содержания рецепторов одних и тех же гормонов может быть различным в премитотических и постмитотических клетках. Разные клетки и ткани, по-видимому, начинают стареть в разное время, и скорости их старения с точки зрения изменения специфических функций могут быть различными.

Большое значение имеет тот факт, что уровень рецептора регулируется не только соответствующим гормоном, но также и другими гормонами и эффекторами. Показано [40], что при введении крольчихам 17β-эстрадиола увеличиваются концентрация рецептора окситоцина и сократимость матки. Вместе с тем прогестерон уменьшает уровень рецептора окситоцина и сократимость матки. Таким образом, содержание одного гормона может зависеть от других гормонов или эффекторов.

Ответ тканей на действие гормонов

Степень ответа клеток или тканей-мишеней на Действие гормонов является наилучшим показателем активности последних. В табл. 5.1 этот показатель для отдельных гормонов рассмотрен как функция возраста. Оптимальный ответ на действие гормона зависит от нескольких факторов, а именно: содержания гормона (которое можно варьировать путем экзогенного введения), содержания рецептора, проникновения гормона в ядро в случае стероидов, активации аденилатциклазы в клеточной мембране в случае пептидных и других гормонов, связывания комплекса Г-Р с хроматином и т. д. Одним из лучших тестов на силу ответа ткани на действие гормона является индукция какого-либо фермента. В ряде работ этот метод использован при введении in vivo и in vitro стероидных гормонов [1, 2, 24, 31]. Было получено четыре варианта изменения индукции [2]: а) в старческом возрасте увеличивался лаг-период, но не менялась величина индукции; 6) уменьшалась или увеличивалась величина индукции; в) менялись и лаг-период, и величина индукции; г) оба параметра оставались постоянными (гл. 3). Было обнаружено также, что индукция стероидными гормонами малатдегидрогеназы, ацетилхолинэстеразы, глутаминсинтетазы, аргиназы, аланинаминотрансферазы и тирозинаминотрансферазы ингибируется актиномицином D [31, 39, 41, 44–46]. Этот факт указывает на то, что индукция в данном случае происходит путем стимуляции транскрипции соответствующих мРНК. Индукция большинства этих ферментов в старческом возрасте нарушается, и это нарушение может происходить на уровне либо транскрипции, либо экспрессии генов, соответствующих изучаемым ферментам. Кроме того, как было показано на примере пируваткиназы, возрастные изменения индукции ферментов зависят также от пола животных и от типа ткани [15–17].

Ответ ткани на действие специфических гормонов может модулироваться другими гормонами. Было показано, что после обработки эксплантатов молочной железы крысы пролактином синтезируется мРНК казеина ([35]. Если в инкубационную среду одновременно с пролактином добавляют гидрокортизон, то синтез мРНК значительно возрастает. Однако если вместо гидрокортизона добавляют прогестерон, то синтез мРНК подавляется. Действие пролактина осуществляется с помощью мембранного рецептора, тогда как действие прогестерона и гидрокортизона — с помощью рецепторов, имеющихся в цитозоле. Как именно пролактин стимулирует синтез мРНК казеина, точно неизвестно, но эти данные представляют собой прекрасный пример того, как разные гормоны, имеющие разные механизмы действия, модулируют активность одного и того же гена. Еще в одной работе, в которой использовали культуру клеток гипофиза, было показано, что секреция этими клетками пролактина стимулируется 17β-эстрадиолом, а этот эффект ингибируется дофамином — основным ингибирующим веществом гипоталамуса [48]. 17β-эстрадиол снимает ингибирующий эффект дофамина, возможно действуя на его рецепторы.

Некоторые исследователи изучали как функцию возраста ответ на действие ряда гормонов целых органов и тканей. Было обнаружено, что изопротеренол индуцирует релаксацию кусочков аорты и этот ответ в старческом возрасте ослабляется [21]. Сократимость сердца при действии катехоламинов с возрастом уменьшается. Исследования in vitro на примере эксплантатов яйцевода цыплят показали, что эстроген стимулирует транскрипцию мРНК кональбумина, а прогестерон препятствует ей [36]. Эстроген усиливает сократимость матки у кроликов, увеличивая концентрацию рецептора окситоцина, тогда как прогестерон ослабляет сократимость, так как снижает содержание этого рецептора [40]. Таким образом, гормоны, если их содержание возрастает, кроме того, что они оказывают влияние на синтез специфических белков путем стимуляции экспрессии специфических генов, могут действовать также на экспрессию других генов. Следовательно, ответ тканей могут изменять весьма небольшие изменения в количестве гормонов.

Выделения глазных желез самки осьминога, Octopus hummelincki, оказывают чрезвычайно сильное действие на свойства животного и, возможно, вызывают его старение и смерть [63]. Самка осьминога откладывает яйца один раз в жизни и высиживает их; одновременно уменьшается потребление ею пищи, и вскоре после вылупления потомства она умирает. Однако если удалить глазные железы после откладки яиц, то самка прекращает высиживание, возобновляет прием пищи и продолжает расти. Какие именно факторы, имеющиеся в глазных железах, ответственны за столь сложную реакцию организма, неизвестно, но очевидно, что они ингибируют некоторые функции. Возникает несколько вопросов. Образуются ли в глазной железе упомянутые выше факторы только после откладки яиц так же, как у млекопитающих после рождения потомства секретируется пролактин, "включающий" образование молока? Действуют ли некоторые из факторов, образующиеся во время откладки яиц, как "включающие" или "выключающие" синтез специфических факторов глазной железы? Если удалить яичник и предотвратить оплодотворение самки, будет ли ее жизнь продолжительнее? По-видимому, изменения в поведении и наступление старости контролируются более чем одним фактором, которые могут прямо или опосредованно контролироваться генами. Очевидно, эти гены активируются или подавляются в определенные периоды жизни.

В некоторых работах изучали соотношение между содержанием некоторых гормонов и функциями, которые, как считают, регулируются ими [9]. Хотя содержание плазматического тестостерона у мужчин не уменьшается до глубокой старости, их способность к воспроизведению нарушается гораздо раньше [32]. Количество эстрогена у женщин также остается высоким примерно до 45 лет, когда наступает менопауза. Однако репродуктивная способность женщин уменьшается значительно раньше [20]. Это означает, что нарушение упомянутых функций происходит на другом уровне, например на уровне рецепторов, перехода комплекса Г-Р в ядро или на уровне акцепторных центров хроматина. После наступления менопаузы увеличивается секреция гонадотропина, что может объясняться нарушением в механизме обратной связи, основанном на эстрогене [4].

Попытки предотвратить возрастные изменения с помощью гормонов

Некоторые исследователи изучали влияние гормонов на продолжительность жизни и жизнеспособность животных. Установлено, что гормоны задней доли гипофиза (кроме гормона роста) и эстроген сохраняют и увеличивают продолжительность жизни, и поэтому считают, что они действуют как "гормоны, поддерживающие жизнь". Гормон роста, тироксин, тестостерон и кортикоиды надпочечника уменьшают продолжительность жизни, и их рассматривают как "гормоны старения" [22]. Для того чтобы сделать окончательное заключение по этому поводу, необходимы дальнейшие исследования. Сообщается, что гормоны гипофиза ускоряют образование поперечных сшивок в коллагене и делают его менее растворимым. Кодда крысам в возрасте 800 дней удаляют гипофиз, их коллаген становится похожим на коллаген 400-дневных крыс [61] (см. другие примеры в гл. 4; рис. 4.9). Еще в 1889 г. Браон-Секар в возрасте 72 лет ввел себе суспензию клеток семенника собаки и сообщил, что это омолодило его. Этот результат, однако, не был подтвержден. Здесь необходимы дальнейшие исследования.

Для репарации в старческом возрасте повреждений, возникающих в индукции ферментов, Канунго и Ганди [31] применили два подхода. Они показали, что в печени старых крыс митохондриальная МДГ не индуцируется кортизоном; однако, если клетки печени начинают в результате гепатэктомии делиться, то гормон индуцирует синтез фермента. Печень состоит из премитотической ткани, клетки которой продолжают с небольшой скоростью делиться на протяжении всей жизни. Поэтому ее можно восстановить и вернуть, хотя бы частично, в состояние, которое она имела на ранних стадиях.

Пока еще не существует методов регенерации таких органов, как скелетная мышца, сердце и мозг, клетки которых являются постмитотическими. В этих органах также наблюдаются нарушения в индукции ферментов. Каким образом можно устранить подобные повреждения? Были сделаны попытки использовать разные уровни гормонов, наблюдающиеся в разные периоды жизни. Содержание пируваткиназы в мозгу, сердце и скелетных мышцах у незрелых крыс обоего пола высокое, но оно уменьшается по окончании периода развития [16, 17]. Кастрация приводит к уменьшению количества фермента. Если крысам давать 17β-эстрадиол (50 мкг на 100 г веса тела), то содержание фермента у старых крыс возрастает до уровня, характерного для среднего возраста (рис. 5.10). Величина индукции зависит от пола и типа ткани. Тестостерон в дозе 10 мкг на 100 г веса увеличивает до такого же уровня содержание холин-ацетилтрансферазы в полушарии головного мозга самок крыс после овариэктомии (рис. 5.11). В этом случае также наблюдается зависимость от пола [27]. Эти работы показывают, что уменьшение содержания некоторых ферментов то окончании репродуктивного периода можно предотвратить путем введения гормонов. Однако такое воздействие следует предпринимать с осторожностью, так как гормон может увеличить содержание интересующего исследователя фермента, но, кроме того, оказать какое-либо побочное действие, которое может принести вред организму. К тому же неизвестно, замедлится ли основной процесс старения при залечивании одного какого-либо дефекта.

Рис. 5.10. Влияние эстрадиола и тестостерона на активность пируваткиназы, выделенной из сердца крыс-самцов [14]

Рис. 5.11. Влияние эстрадиола и тестостерона на активность холин-ацетилтрансферазы из полушария мозга крыс-самок [27]

Хотя детально изучено изменение с возрастом содержания многих гормонов и их эффектов, изменение функции гормонов таких желез, как эпифиз и тимус, еще предстоит исследовать. Известно, что секреты эпифиза регулируют циркадные ритмы разных форм активности животных. Тимус играет важную роль в иммунных функциях организма. По окончании периода развития он подвергается инволюции. Было бы важно знать, имеет ли это какое-либо отношение к процессу старения?

Резюме

Гормоны регулируют различные функции на разных уровнях организации. Они играют важную роль в период развития и ответственны за возникновение у животных репродуктивной способности. Влияние липидорастворимых гормонов — стероидов — осуществляется через специфические рецепторы в цитозоле на уровне генов. Действие пептидных и других гормонов обычно реализуется с помощью рецепторов, имеющихся в клеточных мембранах. Содержание стероидных гормонов в старческом возрасте уменьшается, однако для других гормонов такого закономерного уменьшения на наблюдается. Количество рецепторов некоторых стероидов также понижается в старости, что изменяет ответ тканей на эти гормоны. Примеров возрастных изменений содержания рецепторов пептидных гормонов и ответа тканей на их действие не обнаружено. Индукция некоторых ферментов стероидными гормонами к старости нарушается. Может меняться время, требуемое для индукции, или ее величина. Возрастные изменения в содержании гормонов и в ответе тканей на действие гормонов, однако, не проливают свет на основную причину старения, так как они происходят, по-видимому, из-за нарушения в каком-либо одном или нескольких центрах и, следовательно, являются вторичными.

Литература

1. Adelman R. C. Nature, 228, 1095–1096 (1970).

2. Adelman R. C. In: Enzyme Induction (D. V. Parke, Ed.), 303–311, Plenum Press, New York (1975).

3. Adelman R. C. In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), p. 63–72, Reinhold, New York (1977).

4. Albert A., Randall R. V., Smith R. A., Johnson C. E. In: Hormones and Aging Process (E. T. Eagle and G. Pincus, Eds.), p. 49, Academic Press, New York and London (1956).

5. Anderson J. N., Clark J. H., Peck E. J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 1460–1468 (1972).

6. Andres R., Tobin J. D. In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), 357–378, Reinhold, New York (1977).

7. Baizman E. R., Cox B. Life Sci., 22, 519–529 (1978).

8. Beato M., Kallmi M., Feigelson P. Biochem. Biophys. Res. Commun., 47, 1464–1472 (1972).

9. Bellamy D. Humoral Control of Growth and Differentiation, Vol. 11, 220–279, Academic Press, New York and London (1973).

10. Berg A. P., Zimmerman J. D. Mech. Age. Dev., 4, 377–383 (1975).

11. Bitensky M. W., Russell V., Blanco M. Endocrinology, 86, 154–159 (1970)

12. Brown-Sequard C. E. C R. Soc. Biol., 41, 415–418 (1889).

13. Bylund D. B., Tellez-Inon M. T., Hollenberg M. D. Life Sci., 21, 403–410 (1977).

14. Chainy G. B. N. Metabolic changes during aging, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University (1977).

15. Chainy G. B. N., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 72 777–781 (1976).

16. Chainy G. B. N., Kanungo M. S. J. Neurochem., 30, 419–427 (1978).

17. Chainy G. B. N., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Acta, 540, 65–72 (1978)

18. Cooper B., Gregerman R. J. J. Clin. Invest., 57, 161–168 (1976).

19. Cuatrecasas P. Ann. Rev. Biochem., 43, 169–214 (1974)

20. Dove G. A., Morley F.t Batchelor A., Lunn S. F. J. Reprod. Fert 24 1–8 (1971).

21. Ericsson E., Lundholm L. Mech. Age. Dev., 4, 1–6 (1975).

22. Everitt A. V., Delbridge L. In: Hypothalamus, Pituitary and Aging (A. V. Everitt and J. A. Burgess, Eds.), 193–208, C. C. Thomas, Springfield (1976).

23. Finch C. E. In: Handbook of the Biology of Ageing (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), 262–280, Reinhold, New York (1977).

24. Finch C. E., Foster J. R.t Minsky A. E. J. Gen. Physiol., 54, 690–712 (1969).

25. Freeman C, Karoly K, Adelman R. C. Biochem. Biophys. Res. Commun., 54, 1573–1580 (1973).

26. Gregerman R. I., Bierman E. L. In: Textbook of Endocrinology (R. H. Williams, Ed.), 1059–1070, Saunders, Philadelphia (1974).

27. James T. C. Biochemical changes during aging in mammals. Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University, Varanasi (1976).

28. James T. C., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 72, 170–175 (1976).

29. James T. C., Kanungo M. S. Biochim. Biophys. Acta, 538, 205–211 (1978).

30. Kanungo M. S., Patnaik S. K., Koul O. Nature, 253, 366–367 (1975).

31. Kanungo M. S., Gandhi B. S. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 69, 2035–2038 (1972).

32. Kent J. R., Acone A. B. In: Androgen in Normal and Pathological Conditions, Intern. Cong. Ser. No. 101, p. 31, Excerpta Medica, Amsterdam (1966).

33. Maggi A., Schmidt M. J., Ghetti B., Enna S. J. Life Sci., 24, 367–374 (1979).

34. Manganiello V., Vaughan J. J. Lipid. Res., 13, 12–16 (1972).

35. Matusik R. J., Rosen J. M. J. Lipid Res., 13, 12–16 (1978).

36. McKnight G. S. Cell, 14, 403–413 (1978).

37. Morita L., Koshihara Y., Kawamura M., Murota S. Biochim. Biophys. Acta (1980). In press.

38. Moudgil V. K., Kanungo M. S. Comp. Gen. Pharmacol., 4, 127–130 (1973).

39. Moudgil V. K., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Acta, 329, 211–220 (1973).

40. Nissenson R., Flouret G., Hetcher O. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 75, 2044–2048 (1978).

41. Patnaik S. K., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 845–850 (1974).

42. Paulose C. S. Macromolecular changes as a function of age of the rat, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University, Varanasi, India (1978).

43. Puri S. K., Volicer. Mech. Age Dev., 6, 61–70 (1977).

44. Rao S. S., Kanungo M. S. Mech. Age. Dev., 1, 61–70 (1972).

45. Rao S. S., Kanungo M. S. Ind. J. Biochem. Biophys., 11, 208–212 (1974).

46. Ratha B. K., Kanungo M. S. Mech. Age. Dev., 3, 187–190 (1974).

47. Ratha B. K., Kanungo M. S. Mech. Age Dev., 6, 431–439 (1977).

48. Raymond V., Meaulieu M., Labrie F., Boissier Jr. Science, 200, 1173–1175 (1978).

49. Rosenbloom A. L., Goldstein S., Yip C. C. Science, 193, 412–415 (1976).

50. Roth G. S. Endocrinology, 94, 82–90 (1974).

51. Roth G. S. Brain Res., 107, 345–354 (1976).

52. Roth G. S. In: The Genetics of Aging (D. H. Harrison, Ed.), 365–384, A. R. Liss, New York (1978).

53. Roth G. S. Mech. Age. Dev., 9, 497–514 (1979).

54. Rousseau G. G., Baxter J. D., Tomkins G. H. J. molec. Biol., 67, 99-115 (1972).

55. Shain S. A., Boesel R. W., Axelrod L. R. Arch. Biochem. Biophys., 167, 247–263 (1973).

56. Shire J. M. Nature, 245, 215–216 (1973).

57. Schocken D. D., Roth G. S. Nature, 267, 856 (1977).

58. Singer S., Ito H., Litwack G. Intern. J. Biochem., 4, 569–573 (1973).

59. Spelsberg T. C., Steggles A. W., O'Malley B. W. Biochim. Biophys. Acta, 256, 129–137 (1971).

60. Strehler B. L. Time, Cells and Aging, Academic Press, New York and London (1977). [Имеется перевод 1-го изд.: Стрелер Б. Время, клетки и старение. — М.: "Мир", 1964.]

61. Verzar F., Spichtin H. Gerontologist, 12, 48–56 (1966).

62. Walker J. B., Walker J. P. Brain Res., 54, 391–394 (1973).

63. Wodinsky J. Science, 198, 948–951 (1978).

Глава 6. Образование поперечных сшивок, свободные радикалы и старческий пигмент

Введение

Клетка представляет собой чрезвычайно сложный и динамический химический организм, в котором с помощью ферментов, синтез которых регулируется генами, постоянно образуются различные метаболиты, гормоны и другие сопутствующие вещества. Хотя в основном эти сопутствующие вещества необходимы для клетки или для организма, некоторые из них, если они накапливаются в количестве, превышающем определенный уровень, оказывают вредное действие. Например, промежуточные продукты цикла Кребса имеют отрицательные заряды и могут образовывать поперечные сшивки молекул, обладающих положительными зарядами. Ряд альдегидов обладает высокой реакционной способностью и может вызывать сшивки биомолекул. Известно, что некоторые гормоны оказывают вредное действие, если они накапливаются в количестве, превышающем определенный уровень. Некоторые соединения, например свободные радикалы, образуются в клетках при действии ионизирующей радиации, а также в реакциях окисления, постоянно в них протекающих. Они высоко реакционноспособны и могут инициировать образование поперечных сшивок биомолекул. Следовательно, их необходимо инактивировать или удалять из системы с такой же скоростью, с какой они образуются. Если опасные сопутствующие продукты не удалять, они могут вызывать инактивацию важных биомолекул и накопление поврежденных молекул. Некоторые исследователи полагают, что такие вредные вещества с возрастом накапливаются, так как клетки постепенно теряют способность удалять их с такой же скоростью, с какой они образуются. Подобные изменения могут нарушать функционирование клеток и вызывать старение организма.

Агенты, инициирующие образование поперечных сшивок

Бьёркстен в 1962 г. предположил, что накопление внутри и вне клеток агентов, вызывающих образование поперечных сшивок, приводит к необратимой инактивации функциональных молекул и вызывает нарушение функций организма. Сшивающие агенты могут возникать в процессе нормального метаболизма. К ним относятся альдегиды и молекулы, содержащие одну или несколько ионизированных групп. В молодом возрасте они расходуются в нормальных метаболических процессах, а в старческом накапливаются [4]. В случае если они связываются с биомолекулами, например с ДНК или ферментами, они уже не могут быть удалены и необратимо инактивируют эти молекулы. Верцар высказал предположение [52–54], что увеличение количества нерастворимого коллагена с возрастом происходит из-за образования поперечных сшивок в молекулах пептидов (гл. 4). Считают также, что уменьшение экетрагируемости белков хромосом из хроматина объясняется увеличением числа их сшивок с молекулами ДНК (гл. 2).

Свободные радикалы

Агентами, вызывающими поперечные сшивки, могут служить также свободные радикалы [20, 21]. Теория сшивок и свободно-радикальная теория старения, предложенные соответственно Бьёркстеном (1962) и Харманом (1962), близки, так как обе они включают инактивацию биомолекул в результате поперечных сшивок. Единственное различие между этими теориями заключается в том, что свободные радикалы, обладающие высокой реакционной способностью, кроме сшивок, могут вызывать и другие повреждения.

Свободными радикалами называют атомы или молекулы, имеющие неспаренный электрон. Они обладают высокой реакционной способностью и инициируют образование различных продуктов. В разных организмах найдено значительное количество радикалов [19, 35, 36]. Они могут возникать в клетке по многим механизмам, в основном в органеллах, генерирующих энергию, таких, как митохондрии и хлоропласты. Свободные радикалы образуются в ходе обычного окисления органических соединений молекулярным кислородом; их возникновение катализируется металлами, например медью и железом, согласно следующим схемам:

или

Fe2+ катализирует образование радикалов согласно реакции

Все свободные радикалы обладают рядом определенных свойств и высокой реакционной способностью. Они парамагнитны, так как имеют магнитный момент благодаря наличию неспаренного электрона. Их свободная энергия выше, чем у частиц, из которых они образовались, и они активно окисляют соседние молекулы. Радикалы инициируют перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот. Это приводит к разрушению биологических мембран, содержащих фосфолипиды — эфиры глицерина и ненасыщенных жирных кислот.

Свободные радикалы легко разрушаются вследствие их активной природы и способны образовывать аддукты или инициировать сшивки биологических молекул. Поэтому они обычно инактивируются ферментами типа пероксид-дисмутазы (ПОД), под действием которой происходит дисмутация или перегруппировка двух молекул супероксида:

Каталаза затем катализирует дальнейшее превращение двух молекул перекиси водорода

Супероксид-ион и перекись водорода, образующиеся в клетке, взаимодействуют друг с другом согласно реакции

Радикал ȮH может присоединяться по двойной связи между 5-м и 6-м положениями в молекуле тимидина и нарушать активность ДНК. Радикалы ȮН и НȮ2 чрезвычайно реакционноспособны [40] и имеют очень короткое время полужизни. Радикалы ȮН образуются вместе с гидратированными электронами при действии ионизирующей радиации. Эти радикалы постоянно возникают в организме, и если бы не существовало механизмов, с помощью которых они разрушаются с той же скоростью, что и образуются, то они вызывали бы быструю инактивацию биологических молекул.

К биологическим молекулам, способным помимо ПОД удалять из клетки свободные радикалы, относится витамин Е. Это антиоксидант, защищающий ненасыщенные жирные кислоты от перекисного окисления и препятствующий "размножению" свободных радикалов в ходе перекисного окисления липидов [48]. Сообщается, что другой антиоксидант, этоксихин, увеличивает продолжительность жизни лабораторных мышей на 15–20 %. Когда в пищу мышей добавляли антиоксиданты 2,6-дитрет-бутил-4-метилфенол и меркаптоэтиламин, продолжительность жизни животных возрастала на 30–40 % [22]. Установлено, что антиоксиданты, которые замедляют реакции, протекающие с образованием радикалов как промежуточных продуктов, увеличивают длительность жизни Turbatrix [15]. Таким образом, свободные радикалы и другие агенты, вызывающие сшивки, по-видимому, нарушают функционирование биологических молекул. Однако предстоит еще выяснить, почему они не удаляются или не инактивируются в организме более старых животных так же эффективно, как в организме молодых. Данных о том, что в короткоживущих организмах радикалы генерируются или аккумулируются с большей скоростью, чем в долгоживущих, нет. Не показано также, что уровень радикалов в старых организмах выше, чем в молодых. Кроме того, радикалы являются вторичными продуктами метаболизма и, следовательно, вряд ли могут быть первичной причиной старения.

К потенциальным сшивающим агентам относятся различные альдегиды. Среди них — формальдегид (НСНО), который образуется по меньшей мере в восьми метаболических реакциях, известных до сих пор [4, 5]. Он способен сшивать основания ДНК и инактивировать ее.

Старческий пигмент

Старческий пигмент, называемый также липофусцином ("липо" — жир, "фусцин" — темный), впервые был обнаружен Ходжем в 1894 г. в цитоплазме нейронов старых организмов. Его образование относится к наиболее очевидным и легко наблюдаемым изменениям, возникающим в неделящихся клетках, таких, как нейроны и клетки скелетных мышц [1, 6, 8, 9, 12, 23, 29, 38, 45, 50]. Накопление старческого пигмента в коре и гиппокампе головного мозга человека [17], макака-резуса [11] и крысы [8, 10] является одним из постоянных морфологических признаков старения. Возможно, это накопление служит одной из причин потери нейронов [7, 10, 11]. Липофусцин образуется также и в делящихся клетках, например в клетках печени [16], коры надпочечников [47] и семенников [29]. Откладывание пигмента усиливается при введении кортизона, недостатке витамина Е, гипоксии [42, 46] и при некоторых патологических состояниях, возникающих в раннем возрасте [41]. Его накопление вызывает пропорционально усиливающееся разрушение цитоплазматических структур, например уменьшение массы цитоплазмы, числа митохондрий, шероховатого эндоплазматического ретикулума, упрощение аппарата Гольджи и образование в цитоплазме вакуолей [39] (рис. 6.1).

Рис. 6.1. Изменение с возрастом доли объема клетки, занимаемой липофусцином, цитоплазмой и ядром в больших нервных клетках из nucleus deviatus мозжечка [51].

1 — липофусцин; 2 — цитоплазма; 3 — ядро

Источник образования старческого пигмента пока не выявлен. Ряд исследователей высказывается в пользу лизосом, так как с процессом его образования связаны некоторые гидролазы [2, 12, 14, 44, 50]. Другие [13, 18, 24] считают, что источником липофусцина являются митохондрии. Они предполагают, что он образуется при перекисном окислении полиненасыщенных липидов в этих клеточных органеллах [44, 48]. Липофусцин представляет собой весьма сложное, имеющее сопряженные связи и поперечные сшивки соединение, которое накапливается, как правило, в цитоплазме неделящихся клеток — нейронов, клеток сердечной и скелетной мышц. У крыс его накопление в аэробных тканях интенсивнее, чем в анаэробных [39]. При освещении ультрафиолетовым светом наблюдается его флуоресценция с масимумом между 430 и 490 нм. Липофусцин окрашивается Суданом черным, нильским голубым и ШИК-положителен.

Некоторые ферменты, например кислые и щелочные фосфатазы и глюкуронидаза, образуют с ним ассоциаты. В состав липофусцина входят металлы — цинк и кальций, углеводы, белки и в больших количествах нейтральные и кислые полимерные липиды. Пигмент хорошо растворяется в кислотах. В некоторых тканях его концентрация линейно увеличивается с возрастом, возможно, потому, что клетки утрачивают способность его удалять. Например, его количество линейно возрастает в семенниках мышей [29]. В основном его накопление происходит в клетках Сертоли и интерстициальных клетках, но не в сперматогонии. Высокая способность сперматогония препятствовать накоплению пигмента может быть интересной темой исследования. Накопление липофусцина в гиппокампе и зрительной коре старых крыс протекает быстрее, чем у молодых животных, причем с возрастом одновременно уменьшается количество клеток [10]. Все это должно воздействовать на функции мозга.

Появление в цитоплазме больших количеств неактивного пигмента должно, очевидно, инактивировать клетку. У старых мух Drosophila до 50 % объема клеток занято липофусцином [1]. Однако, если сравнить его содержание у диких дрозофил и у редкого мутанта, имеющего более короткую продолжительность жизни, никакой корреляции не наблюдается. В том и в другом случае пигмент накапливается с одинаковой скоростью. Таким образом, перекисное окисление липидов и накопление старческого пигмента не имеют явного отношения к уменьшению продолжительности жизни. Раннее накопление пигмента наблюдается у людей, страдающих наследственной болезнью- нейронным цероидлипофусцинозом (синдром Баттена — Фогта), а также у собак с ювенильной амавротической идиотией [55]. Значительное отложение пигмента наблюдается у людей, больных хореей Гентингтона и старческим слабоумием.

Липофусцин, очевидно, является побочным продуктом метаболизма и сам не метаболизируется, однако такие лекарственные препараты, как центрофеноксин (β-хлорфеноксиацетиловый эфир диметиламиноэтанола) и диметиламиноэтанол, уменьшают его отложение в нейронах морских свинок и мышей. Введение центрофеноксина в течение 12 нед или более приводит к заметному уменьшению количества старческого пигмента в мозгу морских свинок, крыс и мышей [25, 26, 28, 32, 37, 43]. В нейронах коры головного мозга мышей в возрасте одного месяца старческого пигмента не обнаружено. Он появляется в возрасте 2–3 мес, и затем его количество постепенно возрастает. В гиппокампе обнаружено больше старческого пигмента, чем в коре головного мозга. Если мышам-самкам ежедневно вводить внутрибрюшинно центрофеноксин (80 мг·кг-1 веса) начиная с месячного возраста в течение 2-11 мес, накопление липофусцина в нейронах коры головного мозга и гиппокампа заметно уменьшается (рис. 6.2 и 6.3) [33, 34]. После введения препарата в течение 3 мес улучшаются обучаемость и память 11-12-месячных мышей. Было сделано заключение, что центрофеноксин вызывает разрушение старческого пигмента и тем самым препятствует его накоплению [25, 43]. Хотя несколько исследователей показали, что этот препарат уменьшает накопление липофусцина, остается неясным, происходит ли это из-за предотвращения его отложения или из-за удаления уже отложившегося пигмента. Кроме того, необходимо учесть и оценить побочные эффекты от употребления высоких доз препарата.

Рис. 6.2. Окрашивание липофусцина нильским голубым в нейронах коры головного мозга мышей в возрасте 6 мес; ×600 [33, 34].

 А. Контроль. Б. После введения центрофеноксина в течение 5 мес

Рис. 6.3. Окрашивание липофусцина нильским голубым в нейронах коры головного мозга мышей в возрасте 12 мес; ×600 [33, 34].

А. Контроль. Б. После введения центрофеноксина в течение 11 мес

Старческий пигмент начинает накапливаться по мере старения в цитоплазме Neurospora crassa. При введении нордигидрогваяретовой кислоты (НДГ), обладающей свойствами антиоксиданта, не только уменьшается его накопление, но и увеличивается продолжительность жизни [30]. НДГ и глутатион оказывают такое же действие на Podospora anserina [31].

Причины накопления старческого пигмента еще предстоит выяснить. Если это происходит из-за нарушений метаболизма, необходимо установить, какие факторы ответственны за эти нарушения. Очевидно, однако, что накопление липофусцина является лишь вторичной причиной старения.

Литература

1. Biscardi H. M., Webster G. C. Expl. Gerontol., 12, 201–205 (1977)

2. Bjorkerud S. Adv. Gerontol. Res., 1, 257–288 (1964).

3. Bjorksten J. J. Am. Geriat. Soc., 10, 125–139 (1962).

4. Bjorksten J. Theoretical Aspects of Aging (M. Rockstein, Ed.), 43–59, Academic Press, New York and London (1974).

5. Bjorksten J. In: Protein crosslinking: nutritional and medical consequences (M. Friedman, Ed.), 579–602 (1977).

6. Bourne G. H. Neurobiological Aspects of Maturation and Aging. In: Process in Brain Research (D. H. Ford, Ed.), 187–202, Elsevier, New York (1973).

7. Brizzee K. R. In: Neurobiology of Aging (J. M. Ordy and K. R. Brizzee, Eds.), 401–424, Plenum Press, New York (1975).

8. Brizzee K. R., Cancllla P. A., Sherwood N., Timiras P. S. J. Gerontol., 24, 197–135 (1969)

9. Brizzee K. R., Harkin J. C., Ordy J. M., Kaack B. Aging, 1, 39–78 (1975). 10. Brizzee K. R., Ordy J. M. Mech. Age. Dev., 9, 143–162 (1979).

11. Brizzee K. R., Ordy J. M., Kaack B. J. Gerontol., 29, 366–381 (1974).

12. Brodu H., Vijayashankar N. In: The Handbook of the Biology of Aging (C E Finch and L. Hayflick, Eds.), 248–254, Reinhold, New York (1977).

13. Colocolough H. L., Hack M. M., Helmy F. M., Vaughan G. E., Veath D. C. Acta Histochem., 43, 89-109 (1972).

14. DeDuve C. Symp. Soc. exp. Biol., 10, 50–67 (1957).

15. Epstein J., Gershort D. Mech. Age. Dev., 1, 257–264 (1972).

16. Essner E., Novikoff A. J. Ultra Res., 3, 374–391 (1960).

17. Friede R. L. Topographic Brain Chemistry, Academic Press, New York and London (1966).

18. Glees P., Hasan M., Spoerri P. E. J. Physiol., 239, 87 (1974).

19. Gordon P. In: Theoretical Aspects of Aging (M. Rockstein, Ed.), 61–81, Academic Press, New York and London (1974).

20. Harman D. J. Gerontol., 1, 298–300 (1956).

21. Harman D. Radiat. Res., 16, 753–763 (1962).

22. Harman D. J. Gerontol., 23, 476–482 (1968).

23. Hasan M., Glees P. Expl. Gerontol., 7, 345–351 (1972).

24. Hasan M., Glees P. Expl. Gerontol., 8, 78–83 (1973).

25. Hasan M., Glees P., Spoerri P. E. Cell Tiss. Res., 150, 369–375 (1974).

26. Hochschild R. Expl. Gerontol., 8, 117–183 (1973).

27. Hodge C. F. J. Physiol., 17, 129–134 (1894).

28. Kormendy C. G., Bender A. D. Gerontologia, 77, 52–64 (1971).

29. Miquel J., Lundgren P. R., Johnson J. E. J. Gerontol., 33, 5-19 (1978).

30. Munkres K. D., Rana R. S. Mech. Age. Dev., 7, 399–406 (1978).

31. Munkres K. D., Rana R. S. Mech. Age. Dev., 7, 407–415 (1978).

32. Nandy K., Bourne G. H. Nature, 210, 313–314 (1966).

33. Nandy K. Mech. Age. Dev., 8, 131–138 (1978).

34. Nandy K. J. Am. Gerontol. Soc, 26, 74–81 (1978).

35. Pryor W. A. Sci. Amer, 23, 70–83 (1970).

36. Pryor W. A. Fed. Proc, 32, 1862–1869 (1973).

37. Riga S., Riga D. Brain Res., 72, 265–275 (1974).

38. Samorajski T., Keefe J. R., Ordy J. M. J. Gerontol., 19, 262–276 (1964).

39. Shimasaki H., Nozawa T., Privett O. S., Anderson W. R. Arch. Biochem. Biophys., 183, 443–451 (1977).

40. Sinex F. M. In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), 43–46, Reinhold, New York (1977).

41. Spence A. M., Herman N. M. Mech. Age. Dev., 2, 211–227 (1973).

42. Spoerri P. E., Glees P. Expl. Gerontol., 8, 259–263 (1973).

43. Spoerri P. E., Glees P. Mech. Age. Dev., 3, 131–155 (1974).

44. Strehler B. L. Adv. Gerontol. Res., 1, 343–384 (1964).

45. Strehler B. L., Mark D. D., Mildvan A. S., Gee M. V. J. Gerontol., 14, 430–439 (1951).

46. Sulkin N. M., Srivanji P. J. Gerontol, 15, 2–9 (1960).

47. Szabo D., Desinick C., Okros L., Stack E. Expl. Gerontol., 5, 335–337 (1970).

48. Tappet A. L. Ann. N. Y. Acad. Sci., 203, 12–28 (1972).

49. Tonna E. A. Expl. Gerontol., 8, 9-16 (1973).

50. Tonna E. A. J. Gerontol., 30, 3–8 (1975).

51. Treff W. M. Altern, 37–54, Schattauer, Stuttgart (1974).

52. Verzar F. Gerontologia, 4, 104–111 (1960).

53. Verzar F. Sci. Amer., 208, 104–114 (1963).

54. Verzar F. Intern. Rev. Connect. Tissue Res., 2, 243–299 (1964).

55. Zeman W. Adv. Gerontol. Res., 3, 147–170 (1971).

Глава 7. Изменения иммунной системы

Введение

Животные к старости становятся более восприимчивыми к заболеваниям. За защиту организма от болезней, которые вызываются патогенными бактериями, вирусами, грибами и другими чужеродными агентами, ответственна иммунная система. Эта система не очень хорошо развита у беспозвоночных, но у позвоночных она претерпела значительную эволюцию [127]. Птицы и млекопитающие обладают высокоразвитой и сложной иммунной системой. Млекопитающее способно защитить себя практически от любого чужеродного, "не своего" вещества, которое проникает в его организм. Такие вещества, которые не представлены в организме, называют антигенами. Иммунная система ответственна за сохранность любого органа, который может быть поврежден антигеном. Следовательно, нарушения функций иммунной системы при старении делают организм более восприимчивым к патогенным факторам, увеличивают частоту заболеваний и, следовательно, снижают функциональную активность организма. Имеется несколько основательных обзоров, касающихся иммунной системы и ее возрастных изменений [19, 24, 25, 48, 58, 70].

Иммунная система

Иммунная система позвоночных состоит из костного мозга, тимуса, лимфатических узлов и селезенки (рис. 7.1). У птиц важной частью этой системы является фабрициева сумка. Она представляет собой дивертикул клоаки и является по природе лимфоидным образованием. Клетками, ответственными за создание иммунитета или за предохранение животного от антигена, являются лимфоциты. Развитие иммунокомпетентных лимфоцитов происходит у птиц и млекопитающих следующим образом [19]. Стволовые клетки лимфоцитов происходят из желточного мешка эмбриона. Они мигрируют в печень и селезенку эмбриона и далее в костный мозг. Определенные предшественники лимфоцитов мигрируют из костного мозга в тимус, где они, вероятно, подвергаются некоторой дифференцировке и формируются. Эти клетки затем покидают тимус и расселяются в тимус-зависимой зоне лимфатических узлов и селезенки. Поскольку они формируются в тимусе, их называют Т-лимфоцитами.

Рис. 7.1. Формирование клеток иммунной системы [70]

Т-клетки ответственны за клеточные иммунные реакции, которые защищают организм от патогенных грибов и вирусов. Они также ответственны за отторжение чужеродных тканей и трансплантатов — пересаженных органов и опухолей, за повышенную чувствительность (аллергические реакции) к некоторым антигенам и за аутоиммунные реакции. Иммунный ответ с участием Т-клеток характеризуется непосредственной атакой этими клетками антигена, поэтому такой иммунный ответ называют клеточным ответом, или клеточным иммунитетом. Различают следующие три класса Т-клеток: стимуляторы (хелперы), супрессоры и киллеры. Полагают, что они дифференцируются в тимусе таким образом, что приобретают специфические рецепторы на своей поверхности для распознавания специфических антигенов. Т-хелперы кооперируются с антигенспецифическими В-лимфоцитами и стимулируют выработку специфических белков, обозначаемых в дальнейшем антителами. Супрессорные Т-клетки подавляют выработку антител специфическими В-клетками к специфическим антигенам и, кроме того, препятствуют выработке В-клетками антител к клеткам и молекулам собственного организма. Специфические Т-киллеры распознают антигены типа трансплантатов от несовместимых доноров, опухолей, грибов и т. д., взаимодействуют с ними с помощью своих рецепторов и инактивируют или нейтрализуют их. Функции Т-клеток, возможно, реализуются через секреторные факторы, называемые лимфокинами, которые еще не полностью охарактеризованы. Т-клетки можно отделить от В-клеток, так как они имеют различные иммуноглобулиноподобные поверхностные рецепторы [113, 127]. Если удалить тимус у только что вылупившихся цыплят или новорожденных мышей и крыс, то клеточный иммунитет нарушается. Трансплантация тимуса молодых мышей старым особям или мышам, облученным с целью разрушения их иммунокомпетентных клеток, восстанавливает клеточный иммунитет у реципиентов. Таким образом, тимус участвует в клеточном иммунитете.

У птиц определенные лимфоциты мигрируют из костного мозга в фабрициеву сумку и спустя некоторое время — в лимфатические узлы и селезенку. Эти клетки называются В-лимфоцитами, поскольку они дифференцируются и созревают в фабрициевой сумке (англ. bursa). Эквивалент фабрициевой сумки у млекопитающих не известен. Предполагают, что местом созревания В-лимфоцитов может быть костный мозг. В-клетки ответственны за гуморальный иммунитет. При этом виде ответа клон В-клеток в лимфатических узлах и селезенке после контакта со специфическим антигеном, который достигает их по кровотоку, делится 6–8 раз для выработки высокодифференцированных плазматических клеток. Антиген каждого типа распознается специализированной В-клеткой только одного типа или клоном В-клеток. Для трансформации В-клеток в плазматические требуется их кооперация со специфическими Т-хелперами, также присутствующими в лимфоидных органах. Образующиеся плазматические клетки синтезируют большое число специфических белковых молекул, называемых антителами, или иммуноглобулинами (Ig), которые выделяются в циркулирующую жидкость, гумор. Иммуноглобулины циркулируют в жидкостях организма и при встрече с антигеном, индуцировавшим их синтез, связываются с ним и нейтрализуют его. Млекопитающие и птицы способны вырабатывать иммуноглобулины практически к любому антигену. Иммуноглобулины ответственны за иммунитет к бактериям и вирусам. Поскольку активное начало этого типа иммунитета присутствует в жидкости (гуморе), он называется гуморальным иммунитетом.

В-лимфоциты имеют на поверхности клетки белковые рецепторы, с помощью которых они распознают антиген. В-клетка каждого типа имеет белковый рецептор только одного вида и потому способна распознавать антиген только одного вида. Рецепторами являются иммуноглобулиноподобные молекулы (IgD или IgM), связанные с клеточной поверхностью своими COOH-концами [120]. Их NH2-концы находятся снаружи; они ответственны за распознавание антигена. Предполагают, что иммуноглобулиновые рецепторы синтезируются самой клеткой. Специфические антигенные молекулы связываются с поверхностными рецепторами В-лимфоцитов специфической группы и образуют комплекс антиген — иммуноглобулин. При этом для ответа В-клеток необходима кооперация Т-клеток специфического типа. Предполагают существование двух типов кооперативного действия Т-клеток, хотя точный механизм кооперации неясен. Некоторые Т-клетки кооперируются с В-клетками после их связывания со специфическими антигенами и стимулируют их к делению и выработке плазматических клеток, которые затем синтезируют молекулы иммуноглобулина специфического типа, направленные против данного антигена (рис. 7.2). Это стимулирующие (или хелперные) Т-клетки (рис. 7.3). Вместе с тем некоторые Т-клетки подавляют деление В-клеток после распознавания и, таким образом подавляют гуморальный иммунитет [17]; это Т-супрессорные клетки.

Рис. 7.2. Клональная селекция, приведенная здесь для B-клеток, относится также к Т-клеткам [92]. Существует большое число клонов, или семейств лимфоцитов, каждый из которых коммитирован к ответу на специфический антиген; они вырабатывают антитела к этому антигену даже до контакта с ним и выводят эти антитела на поверхность мембраны в качестве рецепторов (слева). Любой антиген, попавший в организм, связывается только с теми лимфоцитами, которые имеют соответствующие рецепторы на своей поверхности. Такое связывание индуцирует клетки для пролиферации, образования большего количества тех же антител и их секреции

Рис. 7.3. Лимфоциты — клетки, ответственные за иммунные реакции, — развиваются из стволовых клеток. Стволовые клетки мигрируют из костного мозга в тимус и превращаются в тимусные лимфоциты, которые в свою очередь мигрируют в периферические лимфоидные ткани и становятся Т-лимфоцитами. Другие стволовые клетки превращаются в костномозговые лимфоциты, которые мигрируют в периферические лимфоидные органы и становятся В-лимфоцитами. При встрече со специфическим антигеном Т-клетка активируется для осуществления клеточного иммунного ответа, а В-клетка активируется для секреции антител [92]

В тех случаях, когда антиген индуцирует синтез иммуноглобулинов В-клетками, которые действуют под влиянием Т-хелперов, комплексы рецептор — антиген движутся по поверхности клеточной мембраны и агрегируют в одной области этой мембраны, образуя так называемую "шапочку" (по англ. cap; рис. 7.4 и 7.5) [95]. Это происходит вследствие текучести мембраны. Затем комплекс рецептор — антиген поглощается клеткой. Далее следуют 6–8 циклов деления В-клеток в лимфатических узлах и селезенке, во время которых в них увеличивается содержание шероховатого эндоплазматического ретикулума и число полирибосом. Конечным результатом является выработка высокодифференцированных плазматических клеток, которые синтезируют молекулы иммуноглобулина преимущественно одного типа с большой скоростью, пока эти клетки не погибают в течение нескольких дней. Молекулы иммуноглобулина секретируются в кровь, где они встречают специфические молекулы антигена или частицы, связанные с ними, и нейтрализуют их. Таким образом, молекула антигена каждого типа стимулирует только специфический клон В-клеток, который делится и дифференцируется для выработки плазматических клеток. Эти клетки затем синтезируют иммуноглобулины, которые нейтрализуют данный антиген.

Рис. 7.4. Перемешивание поверхностных антигенов человека и мыши в гибридных клетках дало первое явное доказательство того, что белки способны перемещаться по клеточной поверхности. Заражение клеток человека и мыши вирусом вызывает их слияние. Если к слившимся клеткам добавить антитела к антигенам мембраны клеток человека и мыши, соединенные с разными флуоресцирующими красителями, то сначала антигены человека и мыши располагаются на соответствующей половине клетки, но через 40 мин инкубации при 37 °C оба антигена распределяются по всей мембране гибридной клетки

Рис. 7.5. Перераспределение всех иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцита при добавлении одного антигена доказывает моноспецифичность этих клеток. Когда антиген флагеллин добавляют к суспензии В-лимфоцитов мыши, этот белок связывается иммуноглобулиновыми рецепторами небольшого участка поверхности клеток; образовавшиеся комплексы антиген — антитело перемещаются на одну сторону антигенсвязывающих клеток и формируют 'шапочку'; такие комплексы в виде 'шапочки' видны на одной из клеток после обработки антителами к флагеллину, связанному с родамином [92]

Стволовые клетки (предшественники) лимфоцитов мультипотентны. Они дифференцируются и формируются в Т- и В-клетки в тимусе и костном мозгу соответственно при помощи механизмов, которые пока не выяснены. Считают, что за созревание Т-клеток отвечает тимозин, гормон тимуса. Голдстейн [37] сообщил, что тимозин включает в себя ряд полипептидных гормонов. Фракция тимозина α1 является кислым и термостабильным белком. Его полипептидная цепь состоит из 28 аминокислотных остатков и имеет мол. массу ~3108. Фракция α1 вызывает в субпопуляциях Т-клеток изменения, характерные для процесса созревания, а также функциональные изменения in vitro и in vivo. После клинического применения тимозина у детей с врожденным иммунодефицитом обнаруживают увеличение числа Т-клеток и стимуляцию их функции. Сообщают также, что в клинике тимозин увеличивает время жизни больных раком.

Важным свойством иммунной системы является то, что, к счастью, ее лимфоциты не реагируют на собственные клетки и молекулы, иначе эти клетки были бы разрушены, как только собственные лимфоциты стали бы иммунокомпетентными. Предполагают, что это свойство приобретается во время эмбрионального развития за счет разрушения тех предшественников В- и Т-лимфоцитов, которые несут рецепторы для распознавания клеток и молекул хозяина как "своих". В результате в организме развивается толерантность к собственным структурам, т. е. он становится невосприимчивым к действию своей иммунной системы. Оставшиеся предшественники В- и Т-клеток созревают в костном мозгу или тимусе, где появляются клоны В- и Т-клеток, иммунокомпетентные в отношении специфических антигенов. Согласно другой точке зрения, сохраняются все типы В-лимфоцитов, но активность тех из них, которые способны вырабатывать антитела к собственным клеткам организма, подавляется особыми супрессорными Т-клетками. Когда нарушается или снижается в пожилом возрасте функция Т-супрессоров, В-клетки вырабатывают антитела к собственным клеткам и молекулам организма; так возникают аутоиммунные заболевания.

Иммуноглобулины

Основная структура иммуноглобулина включает две короткие, или легкие (L), и две длинные, или тяжелые (Н), цепи. Отсюда молекулярная формула мономера иммуноглобулина L2H2. L-цепь содержит ~216 аминокислотных остатков, и ее мол. масса составляет ~25000. Н-цепь содержит 430 аминокислотных остатков, а ее мол. масса ~50000, т. е. мол. масса Ig ~150000. NH2-конец половины L-цепи, содержащий около 108 остатков, называется вариабельной (V) областью, так как в этой области обнаруживают большинство замен аминокислотных остатков L-цепи различных Ig. Более того, эта область имеет три гипервариабельных (hv) участка, где находится наибольшее число изменений. COOH-конец полуцепи называется константной (С) областью. Каждая L-цепь. ковалентно связана с одной Н-цепью S — S-связью через цистеиновый остаток ее COOH-конца. Известны два типа L-цепей — каппа (χ) и лямбда (λ), которые отличаются друг от друга аминокислотными последовательностями константных областей. Обе L-цепи любого Ig принадлежат к одному типу, χ или λ. L-цепи синтезируются в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме на полисомах, состоящих из 6–8 рибосом. Их синтез происходит независимо от синтеза Н-цепей.

Около 108 остатков NH2-конца Н-цепи, что является первой ее четвертью, составляют вариабельную область. В каждой вариабельной области имеются три гипервариабельных участка. Остальные три четверти Н-цепи являются константной областью. Две Н-цепи Ig ковалентно связаны друг с другом S — S-связями в их константных областях. По последовательности константных областей различают пять типов Н-цепей: альфа, (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ); они положены в основу классификации иммуноглобулинов, в соответствии с которой последние разделяются на пять классов: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Иммуноглобулины D, E и G представлены мономерами. Иммуноглобулин А имеет мономеры и димеры (L2H2)2. Иммуноглобулин М содержит только пентамеры (L2H2)5. Димеризации IgA способствуют две экстраполипептидные цепи — связывающая цепь (J) и секреторный компонент (SC). Пентамерная форма IgM существует благодаря наличию J-цепей, которые ковалентно связывают пять мономеров. Иммуноглобулины всех пяти классов имеют углеводные компоненты, прикрепленные к константным областям их Н-цепей.

Иммуноглобулин А подразделяется на два подкласса по типу Н-цепей: α1 и α2. IgG объединяет четыре подкласса, так как имеются 4 типа γ-цепей: γ1, γ2, γ3 и γ4. Каждый класс или подкласс иммуноглобулинов имеет несколько аллельных вариантов, которые являются взаимоисключающими формами и отличаются аминокислотными последовательностями вариабельных, особенно гипервариабельных участков. Этим объясняется способность животного организма продуцировать для борьбы с тысячами антигенов, которые могут встретиться, иммуноглобулины многих тысяч типов.

Строение иммуноглобулина G иллюстрирует рис. 7.6. Рис. 7.7 дает представление о некоторых характеристиках различных иммуноглобулинов. Гипервариабельные области L- и Н-цепей одной половины молекулы Ig участвуют в связывании одной молекулы антигена, т. е. каждый Ig связывает две молекулы одного и того же антигена. Для выяснения роли различных участков молекулы в иммунном ответе был предпринят структурный анализ IgG. После обработки папаином происходит разрыв S — S-связей в NH2-концевых участках двух Н-цепей, в результате чего освобождаются два антигенсвязывающих фрагмента, каждый из которых содержит L-цепь и NH2-концевой участок одной Н-цепи. COOH-концевые участки двух Н-цепей, соединенные S — S-связями, называются кристаллизуемыми фрагментами Fc. Они ответственны за другие биологические функции, такие, как транспорт иммуноглобулинов крови матери эмбриону через мембрану плаценты во время внутриутробного развития и взаимодействие с клеточной мембраной иммунокомпетентной клетки.

Рис. 7.6. Строение иммуноглобулина G

Рис. 7.7. Класс иммуноглобулинов определяют по типу тяжелой цепи в молекуле. Имеется 5 классов тяжелых цепей: μ, γ, α, δ и ε; классы γ и α имеют подклассы. Кроме того, каждый иммуноглобулин может иметь любую из двух типов легких цепей — χ или λ. Некоторые Ig образуют олигомеры или комплекс, состоящий из нескольких субъединиц. IgM обычно представляет собой пентамер, содержащий пять субъединиц и добавочную 'соединительную' цепь, или J-цепь. IgA может быть мономером, димером или тримером, состоящим соответственно из 1, 2 и 3 субъединиц. J-цепь представлена олигомерными формами и димером; в слюне и слезах она связана с еще одним полипептидом — секреторным компонентом (SC; от англ. secretory component) [19]

Вариабельность иммуноглобулинов

Каждый клон В-лимфоцитов вырабатывает плазматические клетки, которые синтезируют Ig только одного типа. Вариабельные и константные области L- и Н-цепей Ig кодируются различными генами [10, 23, 75, 93, 119, 128]. Имеются три семейства генов иммуноглобулинов. Полагают, что одно семейство состоит из набора генов, кодирующих вариабельные области как L-, так и Н-цепей. Близко на той же хромосоме расположено второе семейство, состоящее из меньшего числа генов, которые кодируют две константные области L-цепи, χ и λ. Третье семейство кодирует константные области различных классов и подклассов Н-цепей. Гены внутри каждого семейства сцеплены, но сами семейства не сцеплены. Каждое семейство генов Ig представлено в гаплоидном наборе хромосом, полученном от одного родителя, только один раз. Предполагают, что проявляются гены только одной из двух хромосом, поскольку известно, что даже у индивидуума, гетерозиготного по генетическому маркеру Ig, в каждой плазматической клетке выражается только один аллель. Это явление называется аллельным исключением [19].

Каков же механизм, благодаря которому в организме животного вырабатываются тысячи типов различных иммуноглобулинов? Этот механизм должен обеспечить селективную экспрессию только одного из двух генов L-цепи, χ или λ; при этом вариабельный ген должен функционировать вместе с константным. По данному механизму определенный вариабельный ген должен функционировать вместе с одним из пяти константных генов для Н-цепи: α, δ, ε, γ, μ. Неизвестно, сколько имеется вариабельных генов. В соответствии с теорией гаметического наследования в геноме представлена вся совокупность необходимых вариабельных генов, однако для их размещения потребовалось бы очень много места. Сторонники теории соматических мутаций полагают, что многообразие вариабельных генов создается мутационным процессом и потому не наследуется.

В настоящее время считается, что гетерогенность антител (т. е. способность организма вырабатывать разнообразные иммуноглобулины для того, чтобы справиться с любым антигеном), вероятно, зависит от наличия в геноме 4–6 генов для вариабельных областей. Согласно этому взгляду, гетерогенность возникает благодаря сочетанию вариабельных генов с очень небольшим числом генов константной области, а также благодаря перестановкам и комбинациям между L- и Н-цепями. Дальнейшие изменения вариабельных генов могут быть вызваны рекомбинациями и соматическими мутациями [10, 25, 93, 103, 104, 119, 128]. Это возможно благодаря существованию гипермутабельных (hv) областей вариабельных генов, которые могут быть предрасположены к таким мутациям.

Гены вариабельных и константных областей L- и Н-цепей не соседствуют друг с другом [10, 23, 75, 93]. В стволовых клетках эмбриона они разделены большими промежуточными областями. Во время процессинга в костном мозге или в фабрициевой сумке V- и С-гены, очевидно, сближаются путем перестройки ДНК, но остаются разделенными промежуточной последовательностью. Селекция V и С-геное возникает, вероятно, после того, как антиген связывается с В-лимфоцитом. При этом V- и С-гены транскрибируются как единый предшественник гетерогенной ядерной РНК (гяРНК), имеющий нетранслируемую последовательность. Затем гяРНК подвергается в ядре сплайсингу и процессингу, в результате чего появляется зрелая мРНК, которая транслируется с образованием L-цепи, имеющей смежные V- и С-области. Описанная модель иллюстрируется рис. 7.8 и 7.9 [93]. В ней видны черты, сходные с транскрипцией и образованием предшественников мРНК для овальбумина и глобулина, которые также имеют промежуточные нетранслируемые последовательности, или интроны.

Рис. 7.8. Двухстадийная модель интеграции константной и вариабельной области гена [93]. Стадия 1: перестройка ДНК и коммитирование клеток к V-гену. На этой стадии V- и С-гены ДНК зародышевой клетки разъединены. В антителопродуцирующей клетке эти гены сближаются, но их все-таки разделяет промежуточная нуклеотидная последовательность. Такая перестройка, или транслокация, ДНК представляет собой классическое 'интеграционное' событие, которое позволяет индивидуальной антителообразующей клетке коммитироваться к V-гену. Стадия 2: функциональная интеграция (связывание V- и С-областей в мРНК). На этой стадии в результате транскрипции активированного гена образуется предшественник ядерной РНК, который включает V-, С-области и промежуточную последовательность. Функциональная интеграция V- и С-областей происходит во время процессинга молекулы-предшественника преимущественно путем образования петли из промежуточных последовательностей и сшивания V- и С-областей. Таким образом, формируется молекула мРНК, на которой образуется полипептид Ig. Полагают, что другие вставки в V-области устраняются при сплайсинге ядерной РНК

Рис. 7.9. Гипотетическая схема экспрессии одного гена VH и многих генов СН [93]. 1. Пул локусов гена VH обозначен набором генов, связанных с несколькими генами СН, расположенными в данном порядке. Для экспрессии выбирается единственный V-ген (VH) и происходит перестройка ДНК, в результате которой гены VXH и С сближаются. Между генами VXH и СН может присутствовать, а может и отсутствовать промежуточная последовательность (обозначена S). В процессе такой перестройки клетка коммитируется к VH-гену и активируется единица транскрипции Н-цепи. 2. В результате транскрипции единицы Н-цепи образуется гигантская молекула предшественника ядерной РНК, которая включает V — С-промежуточную последовательность, VXH-ген и СН-гены. 3. При образовании мРНК в ходе внутриядерного процессинга этой гигантской молекулы может возникать любая комбинация генов VXH и СН. 3а. Например, мРНК VXHCμ может образоваться посредством формирования петли из промежуточной V — С-области, сшивания VXH- и Cμ-областей и деградации оставшейся РНК. 3б. мРНК VXHCδ образуется из того же предшественника формированием петли из последовательностей S и Сμ и сшиванием областей V и Сδ. 3 в. Аналогично образуется мРНК VXHCγ. Поэтому одна клетка может одновременно вырабатывать один, два или три вида мРНК с одним и тем же геном VH, но с разными генами СН. Спейсерные последовательности, которые расположены между СН-генами, определяют специфичность процессинга: эти гипотетические последовательности элиминируются при процессинге ядерной РНК. Данная модель является минимальной, так как она не учитывает гены Сα и Сε, которые тоже могут участвовать в подобном процессе благодаря тому, что предшественник гяДНК может содержать один из этих или оба СН-гена

Механизм, по которому все плазматические клетки, образованные клоном В-клеток, вырабатывают иммуноглобулин только одного типа, по-видимому, включает особое расположение специфических молекул Ig на специфических клонах В-лимфоцитов, подходящее для того, чтобы они могли служить рецепторами. Это может происходить во время созревания стволовых клеток в фабрициевой сумке или костном мозге. Связывание специфического антигена со специфическим иммуноглобулиновым рецептором стимулирует деление В-клеток. На этой стадии может также происходить селекция вариабельного гена, константного гена для χ- и λ-цепей и константного гена для Н-цепи с целью синтеза специфического иммуноглобулина.

Легкие и тяжелые цепи транслируются раздельно на полисомах шероховатого эндоплазматического ретикулума плазматических клеток. Легкие цепи ковалентно связываются с новообразованными тяжелыми цепями. Затем молекулы иммуноглобулина проникают в аппарат Гольджи, где в Н-цепи включается углеводный компонент, после чего молекула секретируется плазматической клеткой. Процесс синтеза молекулы Ig завершается за несколько минут. Поскольку весь белоксинтезирующий механизм плазматической клетки запрограммирован на синтез молекул только одного типа, как в случае ретикулоцитов, синтезирующих только глобин, каждая плазматическая клетка способна в 1 с дать несколько тысяч молекул Ig.

Иммунный ответ

Ответ животного на антиген проверяется введением 0,1–0,5 мг антигена, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (FCA). Для выявления антител используют иммунодиффузию по Ухтерлони или иммуноэлектрофорез в агаровом геле в сыворотке. Если материал обладает антигенными свойствами и животное не имело с ним контакта ранее, Ig определяется через 6–7 дней после введения. Это называется первичным ответом. Введение разрешающих доз антигена с интервалами в 7-10 дней вызывает нарастание уровня Ig в сыворотке примерно до 30-го дня, после чего этот уровень выходит на плато. Если затем прекратить введение антигена, то уровень Ig падает и примерно через три месяца антитела уже не определяются. Если тот же антиген затем ввести через несколько месяцев, то Ig появляются в сыворотке через 3–4 дня, т. е. гораздо быстрее, чем в первый раз. Это называется вторичным ответом. Полагают, что первоначально введение антигена стимулирует специфические В-клетки к делению. Некоторые из этих делящихся клеток образуют плазматические клетки для синтеза Ig. Вместе с тем другие превращаются в долгоживущие клетки памяти. Считают, что именно эти клетки памяти ответственны за раннее распознавание того антигена, который вызвал первичный ответ (рис. 7.3).

Возрастные изменения иммунной системы

Изменения В- и Т-клеток

Для изучения причин снижения иммунной функции были использованы методы in vivo и in vitro [70]. Метод in vivo включает введение суспензии клеток селезенки мыши-донора сингенному, или генетически совместимому, реципиенту, чья иммунная система разрушена облучением или иммунодепрессантами. В этом методе оценивается способность клеток селезенки молодых и старых доноров формировать колониеобразующие единицы (CFU) в селезенке реципиента (рис. 7.10). При использовании другого метода in vivo клетки селезенки мыши-донора помещают вместе с антигеном в диффузионную камеру, которую имплантируют под кожу облученной мыши-реципиента и затем определяют у нее титр антител. Такие исследования проводят с целью установить, вызвано ли снижение иммунной функции изменениями окружения лимфоидных клеток или внутренними изменениями в самих клетках.

Рис. 7.10. Схема метода клеточного переноса для исследования образования антител и стволовых клеток [73]

Функцию В-клеток в период старения определяют по уровню и скорости продукции Ig, вызванной антигеном. Уровень циркулирующих естественных иммуноглобулинов человека снижается с возрастом вскоре после инволюции тимуса, так же как и уровень тимозина [6]. У грызунов первичный, но не вторичный иммунный ответ на антиген в старости снижается [74, 81, 129]. Титр антител после введения антигена падает с возрастом как у мышей, так и у человека (рис. 7.11). Это указывает на то, что функция хелперных Т-клеток или их число после инволюции тимуса может снижаться, что в свою очередь влияет на функцию В-клеток [17]. В определенных случаях, однако, не обнаружено снижения первичного ответа на бактериальные и вирусные вакцины [32, 62]. Это может быть обусловлено либо предшествующим контактом с данным антигеном, либо тем, что на ответ не влияют хелперные Т-клетки.

Рис. 7.11. Снижение титров естественных антител к флагеллину Salmonella с возрастом и увеличение частоты антиядерных факторов у людей обоих полов [99]

С возрастом число В-клеток в селезенке, по-видимому, не изменяется. Об этом свидетельствует постоянное содержание а) клеток, несущих иммуноглобулиновые рецепторы, б) клеток, реагирующих на Т-независимый антиген, и в) клеток, чувствительных к анти-В-реагентам [1, 72]. У человека число циркулирующих В-клеток [22], а также скорость их пролиферации после стимуляции митогеном не меняются [54]. Однако не исключено, что изменениям подвержены субпопуляции В-клеток.

Исследования Прайса и Макинодана [91, 92] показывают, что для максимальной стимуляции образования иммуноглобулина старым мышам требуется в 10 раз больше антигена (эритроциты барана) по сравнению с молодыми. Степень реакции, т. е. число антителообразующих клеток, у молодых мышей также больше (в 25 раз). Это может быть обусловлено одной или несколькими следующими причинами: а) при старении изменяется ткань селезенки и, следовательно, окружение иммунокомпетентных клеток; б) способность В- и Т-клеток старых животных распознавать антиген снижается за счет внутренних изменений в самих клетках; в) снижается абсолютное число В- и Т-лимфоцитов; г) увеличивается число Т-супрессоров и д) снижается функциональная активность В- и Т-клеток, чувствительных к антигену.

С возрастом число стволовых В- и Т-клеток, которые преимущественно локализованы в костном мозгу, по-видимому, не снижается [15, 18]. Стволовые клетки костного мозга делятся в течение всей жизни [66]. Гемопоэтическая активность стволовых клеток, вероятно, также не уменьшается с возрастом [43J Однако нарушается нормальная скорость образования лимфоцитов и клеток крови; это обнаруживается по уменьшению продукции В-клеток после трансплантации костного мозга старого донора молодым тимэктомированным или облученным сингенным реципиентам [27]. Таким образом, скорость, с которой стволовые клетки пролиферируют и дифференцируются, с возрастом падает. Факторы, которые вызывают такие изменения, неизвестны.

Функция Т-клеток оценивается по замедленной кожной чувствительности, реакции трансплантата против хозяина, цитотоксичности, реакции на митогены и активности лимфокинов. Некоторые авторы показали, что иммунокомпетентность Т-клеток по реакции замедленной кожной чувствительности с возрастом снижается [7, 36, 38], так же как и способность мышей отторгать трансплантаты тканей [38, 64]. Это особенно заметно у короткоживущих мышей, склонных к аутоиммунным заболеваниям, но не столь выражено у долгоживущих мышей.

Пролиферативная активность Т-клеток после стимуляции митогенами in vitro у мышей всех линий с увеличением возраста ощутимо снижается [1, 63, 90]. Вместе с тем их цитотоксичность уменьшается незначительно [38], тогда как кооперативная или регуляторная роль Т-хелперов в образовании иммуноглобулинов В-клетками, особенно по отношению к чужеродным эритроцитам, снижается существенно [27, 42, 91, 92].

Иммунная компетентность и заболевания

Частота инфекций, аутоиммунных заболеваний и рака в пожилом возрасте увеличивается. Поскольку снижается главным образом функция Т-, а не В-клеток, должна, вероятно, существовать корреляция между частотой этих заболеваний и компетентностью Т-клеток [16, 68, 107, 121].

Аутоиммунные заболевания

Предполагают, что аутоиммунные заболевания вызываются неспособностью иммунокомпетентных клеток распознавать другие клетки собственного организма; в этом случае к клеткам хозяина вырабатываются иммуноглобулины, как если бы они были "чужими". Аутоантитела разрушают ткани и приводят к аутоиммунным заболеваниям. Возможно, это обусловлено нарушением функции Т-супрессоров, которые считаются ответственными за аутотолерантность [20]. Хирокава и др. [50] сообщили, что у мышей активность Т-супрессоров с возрастом снижается. Возможно, что иммунокомпетентные В-клетки не реагируют на собственные клетки в раннем возрасте по той причине, что Т-супрессоры предотвращают эту реакцию, а не потому, что все В-клетки, которые "ошибаются", исчезают в раннем периоде развития. Так как число и функция Т-супрессоров при старении снижаются, те В-клетки, активность которых была ранее подавлена, начинают реагировать на клетки хозяина, вырабатывая к ним антитела и вызывая аутоиммунные заболевания. Это, однако, не объясняет, почему функция Т-супрессоров при старении снижается.

Индивидуумы, страдающие от аутоиммунных заболеваний, по-видимому, предрасположены к ним генетически. Тиреотоксикоз (болезнь Грейвса), спонтанная недостаточность надпочечников (аддисонова болезнь), пернициозная анемия, ревматоидный артрит, сахарный диабет взрослых и старческий амилоидоз являются аутоиммунными болезнями, которые преобладают в старческом возрасте. Вместе с тем красная волчанка, склеродермия и мышечная дистрофия — это аутоиммунные болезни, которые возникают в молодом возрасте. Аутоиммунные заболевания часто связаны также с вирусными инфекциями. Мыши, тимэктомированные сразу после рождения, имеют высокую частоту аутоиммунных заболеваний [82].

Изучение генетики иммунной системы, особенно тимус-зависимых иммунных функций, уже внесло некоторую ясность в понимание причин аутоиммунитета. Все позвоночные имеют гены главного комплекса тканевой совместимости (МНС; от англ. major histocompatibility complex). У мышей он называется Н-2 и расположен в хромосоме 17. У человека он называется системой HLA и расположен в хромосоме 6. МНС содержит группу из нескольких сотен генетических локусов и поэтому является примером супергена. Он контролирует и регулирует иммунный ответ, особенно тимус-зависимые функции [105, 123, 124]. Было сделано предположение, что МНС участвует в процессе старения [122]. Система Н-2 мышей содержит гены, контролирующие развитие специфических Т-супрессоров для иммунорегуляции цитотоксической реакции лимфоцитов, способность к развитию иммунного ответа на определенные антигены, восприимчивость к некоторым вирусам, аутоиммунные болезни, скорости снижения различных иммунных реакций, систему комплемента, возможно, систему для распознавания "своего" [8], кооперацию клеток Т — В и экспрессию тета-антигена в Т-клетках.

Поскольку почти все перечисленные функции в старческом возрасте нарушаются, анализ системы МНС может пролить некоторый свет на механизмы этих нарушений. Смит и Уолфорд [106] провели анализ продолжительности жизни семи линий мышей, конгенных по системе Н-2. Мыши с наибольшей продолжительностью жизни имели самую высокую реакцию на фитогемагглютинин (ФГА) в течение всей жизни. Линии с наименьшей продолжительностью жизни давали самую низкую реакцию. Поскольку система Н-2 ответственна за реакцию на ФГА, эти результаты указывают на изменения в данной системе генов, которая может не только контролировать иммунный ответ, но и влиять на продолжительность жизни.

Реакция лимфоцитов на чужеродные или измененные клетки, в том числе трансплантаты тканей, включает раннюю фазу, когда лимфоциты распознают трансплантат как антиген. Эта фаза носит название реакции смешанных лимфоцитов (MLR; от англ. mixed lymphocyte reaction), которая контролируется у мышей генами локуса Ia системы Н-2. За распознаванием следует образование Т-киллеров, осуществляющих клеточно-опосредованную лимфоцитотоксичность (CML; от англ. cellmediated lymphocytotoxicity), в процессе которой чужеродные клетки лизируются и разрушаются. Эта реакция контролируется K- и D-локусами системы Н-2 мышей и А- и В-локусами системы HLA человека. Сообщают, что MLR у старых мышей составляет едва одну треть от уровня реакции взрослых животных [63], a CML снижается еще больше [38].

Гуморальный иммунный ответ, который требует Т-кооперации, также заметно снижается с возрастом [61, 73]. Т-супрессоры, которые важны для регуляции иммунного ответа и для предупреждения развития аутоиммунитета, контролируются 1-локусом системы МНС у мышей [105]. Есть сообщение, что активность Т-супрессоров в MLR у старых мышей увеличивается [102], хотя Хирокава и др. [50] отмечают общее снижение активности этих клеток у старых мышей. Их число падает у короткоживущих новозеландских черных мышей (NZB), чувствительных к аутоиммунным расстройствам [114]. Эти исследования показывают, что тимус-зависимые иммунные реакции с возрастом ослабевают, так же как функция Т-хелперов и Т-супрессоров. О тимус-независимых реакциях как функции возраста информация очень скудна.

У людей, страдающих сахарным диабетом взрослых, наблюдаются признаки ускоренного старения: артериосклероз в раннем возрасте, повышение уровня аутоантител и амилоидоз островков Лангерганса. При этом заболевании отмечено также повышение активности гена HLA-B8 системы МНС [118]. Таким образом, между активностью системы МНС и аутоиммунным заболеванием имеется корреляция. Основной вопрос заключается в том, на какие факторы влияет система МНС в пожилом возрасте.

Другие примеры аутоиммунных заболеваний, которые связаны с системой МНС, можно наблюдать у людей, страдающих амилоидозом и наследственной атаксией — телеангиэктазией, обычными болезнями пожилого возраста [121]. Амилоид — это гиалиновый продукт, который откладывается в межклеточном веществе. Предполагают, что амилоидоз обусловлен снижением функции Т-клеток и некоторым усилением функции В-клеток. Наследственная атаксия — телеангиэктазия у человека является иммунодефицитным заболеванием, которое контролируется рецессивным геном. Обычно болезнь проявляется в 6-летнем возрасте, когда у больных исчезают сывороточные и секреторные иммуноглобулины А и Е, уменьшается тимус, наблюдается дефицит клеточного иммунитета. С возрастом для таких больных характерна склонность к развитию опухолей, раннее поседение и ослабление функций половых желез.

Предполагают несколько причин повышения частоты аутоиммунных заболеваний и Т-дефицита в пожилом возрасте: а) усиление иммунной реактивности, вызываемой, возможно, активацией генов иммунного ответа системы МНС; б) повреждение тимуса; в) дефект клеток-мишеней, который приводит к такому изменению их поверхности, что лимфоциты принимают их за "чужие" клетки, и г) происходящий в результате снижения числа Т-супрессоров выход в кровоток некоторых запрещенных клонов лимфоцитов, который находится под контролем супрессорных или регуляторных Т-клеток. Даже если считать эти факты убедительным доказательством взаимосвязи аутоиммунитета и функции тимуса, все же неясно, приводит ли снижение функции иммунной системы к развитию аутоиммунитета или наоборот.

Рак

Частота рака у больных с пониженной иммунной функцией выше, чем средняя. Как у людей, так и у животных вероятность появления опухолей к старости повышается [13, 86, 117]. Известно, что инфекционные и аутоиммунные заболевания чаще встречаются у людей с иммунодефицитами, у которых нарушен главным образом клеточный иммунитет [68, 97]. Это подтверждается следующими данными. Если у больного в условиях иммунодепрессивной терапии развивается аллогенная опухоль, то после прекращения терапии такая опухоль отторгается [86], т. е. иммунодефицит предрасполагает к развитию опухолей. Дальнейшее подтверждение этой связи вытекает из следующих наблюдений: если мышь заразить латентным вирусом, то иммунная система подавляется [53]; заражение мышей вирусом лейкоза подавляет иммунный ответ [30]; у короткоживущих мышей опухоли и аутоиммунные болезни появляются до снижения иммунной функции [80, 132]; продолжительность жизни короткоживущих мышей линии AKR с тимомой после удаления тимуса удваивается [77, 84]; у короткоживущих мышей линии NZB, которые погибают от аутоиммунного заболевания, снижение функции иммунитета прямо связано с уменьшением числа Т-клеток. Таким образом, доступные в настоящее время данные говорят в пользу того, что при снижении иммунной функции в пожилом возрасте не только повышается восприимчивость животных и человека к инфекционным заболеваниям, но увеличивается склонность к аутоиммунным заболеваниям и к развитию опухолей. Если система МНС и участвует в индукции рака, то причина изменений ее функции остается невыясненной.

Имеется ряд примеров, подтверждающих корреляцию между дефицитом иммунокомпетенции и неоплазией. Частота рака примерно в 10–20 раз выше у людей, которые с детства имеют иммунодефицит. Хотя они живут недолго, у них наблюдают высокую заболеваемость раком [108]. Частота рака у людей, имеющих иммунодефицит во взрослом состоянии, также выше, чем у обычных людей [31, 108]. Больные, которым вводили антилимфоцитарную сыворотку (АЛС), имеют более высокую заболеваемость раком потому, что, как полагают, АЛС специфически подавляет функцию Т-клеток [109]. После иммунодепрессии частота спонтанных опухолей у животных и человека возрастает примерно в 350 раз. К тому же после иммунодепрессии у животных легче приживаются трансплантаты опухолей, а частота метастазов пересаженных опухолей выше [83, 108]. Смертность у людей, имеющих дефицит клеточного иммунитета, выше, чем у обычных людей.

Причина высокой частоты неоплазий при иммунодефиците неизвестна. Высказано предположение, что "иммунный надзор" необходим для элиминации злокачественных клеток, которые могут нести "не свои" антигены [13]. Считается, что злокачественное заболевание возникает из-за ослабления в пожилом возрасте Т-клеточного надзора, в результате чего появляются злокачественные клетки. Однако исследование Т-дефицитных мышей (мыши, родившиеся с дефектным тимусом) показало, что Т-клетки не существенны для надзора за некоторыми опухолевыми клетками [110, 111]. Другая возможность заключается в том, что при иммунодефиците онкогенные вирусы лучше размножаются, так как усиление активности Т-супрессоров при неопластических заболеваниях препятствует действию Т-киллеров, которые осуществляют надзор. Итак, взаимосвязь злокачественных заболеваний с иммунодефицитом не вызывает сомнений, но что из них является следствием, а что — причиной, пока неизвестно; механизм, посредством которого одно может влиять на другое, остается невыясненным.

Ослабление функции тимуса

Несколько авторов сообщили о том, что структурная и функциональная инволюция тимуса заканчивается в периоде, предшествующем завершению роста. Морфологические исследования Эндрью [4] и Сантисбибена [101] показали, что вес лимфоидной ткани тимуса начинает снижаться вскоре после достижения половой зрелости. Это происходит главным образом за счет атрофии коркового вещества (рис. 7.12); затем следует снижение уровня тимозина и числа Т-клеток [59]. Сколько-нибудь заметного уменьшения размеров лимфатических узлов и селезенки не наблюдали, но число центров размножения в этих органах снижается [16, 59, 89]. Количество циркулирующих Т-клеток прогрессивно падает после прохождения зрелого возраста, а их число у 60-70-летних людей составляет только ~70 % уровня, характерного для молодых [5, 22, 96]. У мышей функция Т-клеток при старении также снижается [38, 39, 68, 88, 112, 116]. Устойчивость к аллогенным опухолевым клеткам и пролиферативный ответ клеток селезенки на аллогенные клетки с возрастом быстро падают [88].

Рис. 7.12. Возрастные изменения компонентов тимуса человека [9]

Т-клетки проходят через тимус. Тимус подвергается обратному развитию вскоре после достижения половой зрелости, и этому сопутствует снижение определенных функций иммунитета. Предполагают, что ослабление иммунной функции вызвано уменьшением активности тимуса. Некоторые экспериментальные данные подтверждают это предположение. Снижение тимус-зависимых функций иммунитета возникает в период половой зрелости, когда тимус начинает подвергаться инволюции, и, следовательно, задолго до того, как проявляются иммунодефицитные заболевания пожилого возраста [74]. Иммунодефицит, амилоидоз и аутоиммунитет у неонатально тимэктомированных и генетически восприимчивых мышей можно предупредить или устранить пересадкой тимуса от молодых сингенных но не от старых мышей [26, 134]. Системная красная волчанка и рассеянный склероз у человека [40], а также патология мышей NZB, которая напоминает системную красную волчанку, вероятно, вызваны реакцией хозяина на некоторые вирусные антигены [78, 130]. Заболевание у мышей NZB развивается после снижения Т-ответа [110]. Начало этого заболевания можно замедлить введением тимоцитов молодых сингенных мышей [35]. У человека синтез антител к ядрам клеток, который является Т-зависимым, с возрастом усиливается [99].

Если считать, что частота рака в обычной популяции только 1:300, то у людей с иммунодефицитами, выявленными в детстве, она составляет 1:20, несмотря на то что продолжительность периода, в течение которого обычно развивается рак, у них меньше [31]. Как у животных, так и у человека иммунодепрессия под действием лекарств способствует увеличению заболеваемости раком [11]. Например, риск развития ретикулосаркомы у больных с иммунодепрессией примерно в 350 раз выше, чем у здоровых людей. Иммунодепрессия способствует приживлению пересаженных опухолей, а также метастазированию у человека и у животных [11, 135]. У людей со сниженным клеточным иммунитетом более высокая смертность, чем в общей популяции [69, 97]. Все эти наблюдения свидетельствуют о том, что с возрастом Т-клеточная функция нарушается, и это приводит к увеличению частоты рака, аутоиммунных и других заболеваний. Замедление или предупреждение снижения функции Т-клеток может отсрочить начало этих заболеваний или по крайней мере облегчить их протекание и тем самым замедлить процесс старения.

Некоторые данные, полученные in vitro, подтверждаются наблюдениями in vivo. Пролиферативный ответ Т-клеток на растительные митогены ФГА и конканавалин А у мышей и человека с возрастом значительно снижается [1, 29, 41, 56, 63, 88, 90, 97]. Вряд ли это обусловлено уменьшением связывания митогенов с рецепторами клеточных мембран [54], так как количество 125I-ФГА одинаково в молодых и старых клетках. Причиной могут быть молекулярные изменения, поскольку известно, что уровень циклического ГМФ (cGMP) после стимуляции митогеном в старых клетках увеличивается меньше, чем в молодых [45]. Правда, Эгервол и др. [2] сообщают, что при 37 °C ФГА одинаково стимулирует к делению и молодые, и старые клетки. Митотическая активность была изучена по включению 3Н-тимидина (рис. 7.13). Точность считывания ДНК-полимеразой в лимфоцитах двух доноров разного возраста тоже была одинаковой, хотя "старый" фермент оказался более термолабильным. Известно, кроме того, что ацетилирование гистонов в лимфоцитах, стимулированных ФГА, с возрастом снижается [85]. У мышей по мере старения замедляется образование цитотоксических лимфоцитов в смешанной культуре [47] и ослабевает функция Т-хелперов [42, 46, 91, 92].

Рис. 7.13. Снижение митогенного ответа на фитогемагглютинин со стороны Т-клеток селезенки долгоживущих мышей [52]

Тимэктомия у взрослых мышей способствует снижению их иммунного ответа, что заметно по ослабленной реакции трансплантата против хозяина, уменьшению уровня антител, вырабатываемых к бычьему сывороточному альбумину, ослабленному ответу на ФГА и плохому общему состоянию [79, 115]. Когда тимус мыши-донора в возрасте от 1 дня до 33 мес пересаживают бестимусным молодым реципиентам, наблюдают снижение с возрастом донора дифференциации или созревания клеток-предшественников с образованием функционально активных Т-клеток у реципиента. При этом вторичное заселение лимфоцитами органов реципиента и реактивность его Т-клеток к ФГА резко уменьшаются.

Кэй [55, 56] наблюдала прекращение миграции стволовых клеток в тимус у мышей после 6–8 нед. Это может быть причиной снижения выработки дифференцированных Т-клеток типа хелперов, супрессоров и киллеров, обеспечивающих специфические иммунные реакции, что подтверждается следующими наблюдениями. Доля Т-клеток, несущих тета-антиген, с возрастом снижается, так же как и число тета-антигенов на поверхности клетки [12]. Продолжительность жизни короткоживущих карликовых мышей с гипофункцией гипофиза может быть увеличена с 4 до 12 мес введением клеток лимфатических узлов, но не костного мозга или тимоцитов [26]. Это указывает на то, что снабжение специализированными клетками лимфатических узлов, которое требуется для нормальной иммунной функции, прекращается в раннем периоде жизни и что благодаря восполнению этих клеток животные приобретают защиту от болезней и их продолжительность жизни увеличивается. Уровень тимусного гормона (тимозина) в сыворотке начинает снижаться после инволюции тимуса [6]. Этот гормон требуется для дифференцировки Т-клеток. Описанные исследования свидетельствуют о том, что с возрастом нарушается функция тимуса, который отвечает за предохранение организма от инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также от рака. Следовательно, может происходить постепенное ослабление устойчивости организма к указанным заболеваниям, что приводит к снижению жизнеспособности. Однако нарушения функции характерны не только для тимуса, они отмечаются почти во всех органах. Итак, главный вопрос остается открытым: как и почему нарушается функция тимуса после достижения половой зрелости? Другая группа клеток, включающая главным образом макрофаги, играет вспомогательную роль в иммунном ответе. Как именно они вовлекаются в иммунные реакции, неизвестно. По своей природе они являются фагоцитами и обычно противостоят антигенам до встречи последних с В- и Т-клетками. С возрастом фагоцитарная активность перитонеальных вспомогательных клеток мышей не меняется; об этом свидетельствует активность лизосомных ферментов: катепсина D, β-глюкуронидазы и кислой фосфатазы. То же самое можно сказать и об их способности индуцировать антителообразование [44, 87]. Вспомогательные клетки селезенки также не теряют способность кооперироваться с В- и Т-клетками, необходимую для инициации иммунного ответа [46].

Попытки коррекции иммунной функции

Поскольку к старости функция иммунитета ослабевает и одновременно увеличивается частота инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также склонность к развитию опухолей, полагают, что возникновение этих заболеваний можно предупредить или отсрочить улучшением иммунного статуса животного. Для усиления иммунокомпетентности организма после достижения половой зрелости был предложен ряд мер: изменение рациона, пересадка иммунокомпетентных клеток, оперативное вмешательство, применение лекарственных препаратов и понижение температуры тела. Мак-Кей и др. [76] первыми сообщили, что при снижении калорийности пищи продолжительность жизни крыс значительно увеличивается. Уолфорд и др. [125] показали, что при ограниченной калорийности пищи иммунная система у крыс развивается медленно и также медленно ослабевает. Таким образом, рацион влияет на скорость развития и угасания иммунной функции. Было показано также, что в указанных экспериментальных условиях отдаляется момент возникновения старческих болезней [98]. Пища с низким содержанием жира, но богатая белком, способствует подавлению развития аутоиммунных заболеваний и увеличению продолжительности жизни мышей [28]. Изменением рациона иммунная функция может быть улучшена на определенный период, но в конце концов она снижается.

Пересадка большого числа клеток (108 клеток на одно животное) лимфатических узлов молодой мыши короткоживущему реципиенту с гипофизарной карликовостью и недостаточностью гормона роста увеличивает продолжительность его жизни в 3–4 раза [26]. Очевидно, клетки лимфатических узлов стимулируют функцию гипофиза или выполняют некоторые гипофиз-зависимые функции. После упомянутой выше пересадки у мышей NZB их продолжительность жизни увеличивалась только на 1 мес [65], а развитие заболеваний не предотвращалось [131]. Введение клеток тимуса молодых мышей старым животным линии A/J препятствовало появлению некоторых типов аутоантител, но продолжительность жизни при этом увеличивалась незначительно [133]. Однако когда клетки тимуса и костного мозга одновременно пересаживали от молодых старым мышам, то иммунный статус последних существенно улучшался и их продолжительность жизни увеличивалась [49, 71].

В качестве хирургических методов исправления иммунного статуса было предложено удаление тимуса и селезенки. Фюрт [33] показал, что если удалить тимус у мыши линии AKR, восприимчивой к тимоме, перед появлением признаков опухоли, то продолжительность жизни животного увеличивается. Удаление селезенки у мыши линии BC3F1 в 2-летнем возрасте непосредственно перед развитием ретикулосаркомы также приводит к увеличению продолжительности ее жизни (в 2 раза) [3]. Создается впечатление, что селезенка является местом развития вирус-зависимой опухоли, причем хирургическим путем не только можно предотвратить появление опухоли, но и увеличить продолжительность жизни.

Для улучшения иммунной компетентности старых животных использовали многие препараты, в том числе гормоны. Применение гормона тимуса быка увеличивает продолжительность жизни короткоживущих, восприимчивых к аутоиммунным заболеваниям мышей [21], но подобный эффект отсутствует для долгоживущих мышей [94]. Химические препараты типа меркаптоэтанола, полинуклеотидов, витамина Е и полиионов несколько усиливают иммунную функцию (ссылки см. в работе [60]), но основания для применения таких препаратов недостаточны, так как проведенные исследования еще не позволяют глубоко разобраться в причинах старения.

Продолжительность жизни рыб значительно увеличивается, если их содержать при низкой температуре, особенно во второй половине жизни [34, 67]. Причиной может быть снижение скорости метаболизма, что способствует замедлению старения. При низкой температуре метаболизм подавляется и одновременно замедляется созревание иммунной системы. Если этот способ применить на ранних стадиях развития, то можно достичь увеличения продолжительности жизни.

Более строгий подход к улучшению иммунного статуса животных заключается в пересадке иммунокомпетентных клеток молодых доноров старым совместимым реципиентам. Если клетки донора будут нормально функционировать в течение длительного времени, то старое животное будет меньше болеть и проживет дольше. Поэтому необходимо типировать по антигенам тканевой совместимости иммунокомпетентные клетки и молодых доноров, и старых реципиентов, как это требуется при переливании крови. Еще более реальным и эффективным методом может стать хранение иммунокомпетентных клеток больных, взятых у них в юности, и переливание этих клеток тем же людям, когда они состарятся. Так можно избежать реакции трансплантата против хозяина. Клетки селезенки остаются живыми даже после хранения в течение 16 лет [70]. Есть данные о том, что стволовые клетки и ткань тимуса молодых мышей, пересаженные старым мышам, увеличивают продолжительность жизни последних [51].

Резюме

Иммунная система ответственна за защиту организма от различных болезней, которые вызываются патогенными факторами. Известно, что частота инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также рака после достижения половой зрелости возрастает. Иммунокомпетентность человека и животных при старении снижается. Возможно, что за потерю здоровья в зрелом возрасте ответственны повреждение иммунной системы и сопутствующая ему склонность к заболеваниям.

Иммунные реакции животных и человека на различные чужеродные вещества, вирусы, бактерии и чужеродные клетки осуществляются лимфоцитами двух видов — В- и Т-клетками. В-клетки формируются в фабрициевой сумке у птиц и в костном мозгу у млекопитающих. После стимуляции специфическим антигеном они вырабатывают специфические антитела или иммуноглобулины. Иммуноглобулин инактивирует антиген. Функция В-клеток зависит от кооперации с Т-клетками. Исследования последних лет показывают, что функция В-клеток с возрастом существенно не нарушается.

Т-клетки формируются в тимусе. Известны три вида Т-клеток: хелперы, супрессоры и киллеры. Т-хелперы необходимы для образования иммуноглобулинов В-клетками. Т-супрессоры подавляют образование иммуноглобулинов и, по-видимому, ответственны за аутотолерантность, так как они удерживают лимфоциты от реакции на собственные клетки хозяина. Т-киллеры непосредственно реагируют с антигенами и инактивируют их. Исследования in vivo и in vitro показали, что число Т-клеток различных видов после достижения половой зрелости снижается, а их функционирование ухудшается. Некоторые функции Т-клеток, вероятно, контролируются сложным набором генов — системой МНС. Не исключено, что ослабление Т-функций вызвано изменениями этих генов.

Хотя причина нарушения иммунной функции остается неясной, были предприняты попытки стимулировать эту функцию у старых животных путем пересадки иммунокомпетентных клеток от молодых животных. Такие методы позволяют отсрочить на некоторое время возникновение болезни и увеличить продолжительность жизни.

Литература

1. Adler W. H., Takiguchi T., Smith R. T. J. Immunol., 107, 1357–1362 (1971).

2. Agarwal S. S., Tuffner M., Loeb L. A. J. Cell Physiol., 96, 235–244 (1978).

3. Albright J. F., Makinodan T., Deitchman J. W. Expl. Gerontol., 4, 267–276 (1969).

4. Andrew W. In: Cellular Changes with Age (G. H. Thomas, Ed.), Springfield, Illinois (1952).

5. Augener W., Cohnen G., Reuter A., Brittinger G. Lancet, 1, 1164 (1974).

6. Bach F. J., Dardenee M., Salomon J. C. Clin. exp. Immunol., 14, 147–256 (1973).

7. Baer H., Bowser R. T. Science, 140, 1211–1212 (1963).

8. Bevan M. J. Nature, 256, 419–421 (1975).

9. Boyd E. Amer. J. Dis. Child, 43, 1162–1214 (1932).

10. Brack C., Hirama M., Lenhard-Schuller R., Tonegawa S. Cell, 15, 1-14 (1978).

11. Braun W., Yajima Y., Ishizuka M. J. Reticuloendothel. Soc, 7, 418–424 (1970).

12. Brennan P., Jaroslow B. Cell. Immunol., 15, 51–56 (1975).

13. Burnet M. F. Immunological Surveillance, Pergamon Press, Oxford (1970).

14. Cerilli J., Hattan D. Amer. J. Clin. Pathol., 62, 218–223 (1974).

15. Chen M. G. J. Cell Physiol, 78, 225–232 (1971).

16. Chino F., Makinodan T., Lever W. H., Peterson W. J. J. Gerontol., 26, 497–507 (1971).

17. Clamen H. N., Chaperon E. A. Transplant. Rev., 1, 92-113(1969).

18. Coggle J. E., Proukakis C. Gerontologia, 16, 25–29 (1970).

19. Cooper M. D., Lawton A. R. Sci. Amer., 231, 58–72 (1974).

20. Cunningham A. J. Transplant. Rev., 31, 23–43 (1976).

21. Dauphinee M. J., Talal N., Goldstein A. L., White A. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 71, 2637–2641 (1974).

22. Diaz-Jouanen E., Strickland R. G., Williams R. C., Jr. Am. J. Med., 58, 620–628 (1975).

23. Dreyer W. J., Bennett J. C. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 54, 864–868 (1965).

24. Edelman G. M. Sci. Amer., 223, 34–42 (1970).

25. Edelman G. M. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 41, 891–902 (1977).

26. Fabris N., Pierpaoli W., Sorkin E. Nature, 240, 557–559 (1972).

27. Farrar J. J., Loughman B. E., Nordin A. A. J. Immunol., 112, 1244–1249 (1974).

28. Fernandes G., Yunis E. J., Jose D. G., Good R. A. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 44, 770–782 (1973).

29. Fernandez L. A., MacSween J. M., Langley G. R. Immunology, 31, 583–587 (1976).

30. Friedman H., Ceglowski W. S. Prog. Immunol., 1, 815–829 (1971).

31. Fudenberg H. H. Amer. J. Med., 51, 295–298 (1971).

32. Fulk R. V., Fedson D. S., Huber M. A., Fitzpatrick J. R., Kasel J. A. J. Immunol, 104, 8-13 (1970).

33. Furth J. C. J. Gerontol., 1, 46–52 (1946).

34. Gerbase-Delima M., Liu R. K., Cheney K. E., Mickey R., Watford R. L. Gerontologia, 21, 184–202 (1975).

35. Gershwin M. E., Steinberg A. D. Clin. Immunol. Immunopathol., 4, 38–45 (1975).

36. Giannini D., Sloan R. S. Lancet, 1, 525–527 (1957).

37. Goldstein A. L. Symp. Immune System, XI Internat. Cong. Gerontol., pp. 22–23, Japan (1978).

38. Goodman S. A., Makinodan T. Clin. exp. Immunol., 19, 533–542 (1975).

39. Grossman J., Baum J., Fusner J., Condemi J. J. Allergy Clin. Immunol., 55, 268–275 (1975).

40. Gyorkey F., Min K. W., Sincovics J. G., Gyorkey P. New Eng. J. Med., 280, 33 (1969).

41. Hallgren H. M., Buckley C. E., Gilbertsen V. A., Yunis E. J. J. Immunol., Ill, 1101–1107 (1973).

42. Hardin J. A., Chuseo T. M., Steinberg A. D. J. Immunol., Ill, 650–651

43. Harrison D. E. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 70, 3184–3188 (1973).

44. Heidrick M. L. Gerontologist, 12, 28 (1972).

45. Heidrick M. L. J. Cell. Biol., 57, 139a (1973).

46. Heidrick M. L., Makinodan T. J. Immunol., Ill, 1502–1506 (1973).

47. Hiwano T., Nordin A. A. J. Immunol., 117, 1093–1098 (1976).

48. Hirokawa K. In: Immunity and Aging (T. Makinodan and E. Yunis, Eds.), 51–72, Plenum Press, New York (1977).

49. Hirokawa K., Albright J. W., Makinodan T. Clin. Immunol. Immunopathol., 5, 371–376 (1976).

50. Hirokawa K., Hatakeyawa S., Sado T. Sym. Immune System. Xlth Internet. Cong. Gerontol., p. 2, Tokyo (Abs.) (1978).

51. Hirokowa K., Makinodan T. J. Immunol., 114, 1659–1664 (1975).

52. Hori Y., Perkins E. H., Halsall M. K. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 144, 48–53 (1973).

53. Hotchin J. E. In: Tolerance, Autoimmunity and Aging (M. M. Sigel and R. A. Good, Eds.), Charles С Thomas, Springfield (1972).

54. Hung C. Y., Perkins E. H., Yang W. K. Mech. Age. Dev., 4, 103–112

55. Kay M. M. B. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 72, 3521–3525 (1975).

56. Kay M. M. B. In: Genetic Effects of Aging (D. Bergsma and D. Harrison, Eds.), p. 213, A. R. Liss, New York (1978).

57. Kay M. M. B. Fed. Proc, 37, 1241–1244 (1978).

58. Kay M. M. B. Mech. Age. Dev., 9, 39–59 (1979).

59. Kay M. M. B., Mendoza J., Denton T., Union N., Lajiness M. Mech. Age. Dev. (1978). (In press.)

60. Kay M. M. B., Makinodan T. Clin. Immunol. Immunopathol., 6, 394–413 (1976).

61. Krishimoto S., Takahama T., Mizumachi H. J. Immunol., 116, 294–300 (1976).

62. Kishimoto S., Tsuyuguchi I., Yamamura Y. Clin. exp. Immunol., 5, 525–530 (1969).

63. Konen T. G., Smith G. S., Walford R. L. J. Immunol., 110, 1216–1221 (1973).

64. Krohn P. L. Proc. Roy. Soc. (B), 157, 128–147 (1962).

65. Kysela S., Steinberg A. D. Clin. Immunol. Immunopathol., 2, 133–136 (1973).

66. Lajtha L. J., Schofield R. Adv. Gerontol. Res., 3, 131–146 (1971).

67. Liu R. K., Watford R. L. Gerontologia, 18, 363–388 (1972).

68. Mackay I. R. Gerontologia, 18, 285–304 (1972).

69. Mackay I. R., Whittingham S., Mathews J. D. In: Immunology and Aging (T. Makinodan and E. Yunis, Eds.), p. 35, Plenum Press, New York (1977).

70. Makinodan T. (1977). In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), pp. 379–408, Reinhold, New York (1977).

71. Makinodan T. Mech. Age. Dev., 9, 7-17 (1979).

72. Makinodan T., Adler W. H. Fed. Proc, 34, 153–158 (1975).

73. Makinodan T., Perkins E. H., Chen M. G. Adv. Gerontol. Res., 3, 171–198 (1971).

74. Makinodan T., Peterson W. J. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 48, 234–238 (1962).

75. Matthyssens G., Tonegawa S. Nature, 273, 763–765 (1978).

76. McCay C. M., Crowell M. F., Maynard L. A. J. Nutri., 10, 63–79 (1935).

77. McEndy D. P., Boon M. C., Furth J. Cancer Res., 4, 377–383 (1966).

78. Mellors R. C., Huang C.-Y. J. exp. Med., 124, 1031–1038 (1966).

79. Metcalf D. Nature, 208, 1336 (1965).

80. Metcalf D., Moulds R. Intern. J. Cancer., 2, 53–58 (1967).

81. Metcalf D., Moulds R., Pike B. Clin. exp. Immunol., 2, 109–120 (1966).

82. Milter J. A. F. P., Howard J. G. J. Reticuloendothel. Soc, 1, 369–392 (1964).

83. Morse H. C., Steinberg A. D., Schur P. H., Reed N. D. J. Immunol., 113, 688–697 (1974).

84. Nakakuki K., Shisa H., Nishizuka Y. Acta Haematol., 38, 317–323 (1967).

85. Oh Y. H., Conrad R. A. Life Sci., 11, 677–684 (1972).

86. Penn I., Starzl T. E. Transplantation, 14, 407–417 (1972).

87. Perkins I. H. J. Reticuloendothel. Soc. (Abs.), 9, 642–643 (1971).

88. Perkins E. H., Cocheiro L. H. Mech. Age. Dev., 6, 15–24 (1977).

89. Peter C. P. J. Gerontol., 28, 265–275 (1973).

90. Pisciotta A. V., Westring D. W., Deprey C., Walsh B. Nature, 215, 193–194 (1967).

91. Price G. B., Makinodan T. J. Immunol., 108, 403–412 (1972).

92. Price G. B., Makinodan T. J. Immunol., 108, 413–417 (1972).

93. Rabbitts T. H. Nature, 275, 291–296 (1978)

94. Radl J., Adler W. H. Prog. Immunol., 2, 412 (1974).

95. Raff M. C. Sci. Amer., 234 (5), 30–39 (1976).

96. Reddy M. M., Goh K. J. Gerontol., 34, 5–8 (1979).

97. Roberts-Thomson I. C., Whittingham S., Young-Chaiyud U., Mackay I. R. Lancet, 2, 368–570 (1974).

98. Ross M. H., Bras G. J. Natl. Cancer Inst, 47, 1095–1113 (1971).

99. Rowley M. J., Buchanan H., Mackay I. R. Lancet, 2, 24–26 (1968).

100. RygaardJ., Povlson C. O. Transplantation, 17, 135–136 (1974).

101. Santisbeban G. A. Anat. Rec, 136, 117–126 (1960).

102. Segre D., Segre M. J. Immunol., 116, 735–738 (1976).

103. Seidman J. G., Leder P. Nature, 276, 790–795 (1978).

104. Seidman J. G., Leder A., Nau M., Norman B., Leder P. Science, 202, 11–17 (1978).

105. Shreffler D. C. In: HLA and Disease (J. Dausset and A. Svejgaard, Eds.), 32–45, Williams and Wilkins, Baltimore (1977).

106. Smith G. S., Walford R. L. Nature, 270, 727–729 (1977).

107. Smith G. S., Walford R. L., Mickey R. J. Natl. Cancer. Inst., 50, 1195–1213 (1973).

108. Southam C. M. Amer. J. Clin. Pathol., 62, 224–242 (1974).

109. Stewart P. B., Bell R. Nature, 227, 279 (1970).

110. Slutman O. J. Immunol., 109, 602–611 (1972).

111. Stutman O. Science, 183, 534–536 (1974).

112. Stutman O., Yunis E. J., Good R. A. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 127, 1204–1207 (1968).

113. Szenberg A., Marchalonis J. J., Warner N. L. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 74, 2113–2117 (1977).

114. Tateal N., Steinberg A. D. In: Current Topics in Microbiology and Immunology, p. 70, Springer-Verlag, New York (1974).

115. Taylor R. Nature, 208, 1334–1335 (1965).

116. Teague P. O., Yunis E. J., Rodey G., Fish A. J., Stutman O., Good R. A. Lab. Invest, 22, 121–130 (1970).

117. Teller M. N. Adv. Gerontol. Res, 4, 25–43 (1972).

118. Thomsen M., Platz P., Andersen O. O., Christy M., Lyngsoe J., Nerup J., Rasmussen K., Ryder L. P., Nielson L. S., Svejgaard A. Transplant. Rev., 22, 125–147 (1975).

119. Valbuena O., Marcu K. B., Weigert M., Perry R. P. Nature, 276, 780–784 (1978).

120. Vitetta E. S., Uhr J. W. Transplant. Rev, 14, 50–75 (1973).

121. Watford R. L. The Immunologic Theory of Aging, Munksgaard, Copenhagen (1969).

122. Walford R. L. Fed. Proc, 33, 2020–2027 (1974).

123. Walford R. L. In: HLA System: New Aspects (G. B. Ferrara, Ed.), 105–127, Elsevier, Amsterdam (1977).

124. Walford R. L. In: The Genetics of Aging (E. L. Scheider, Ed.), pp. 383–401, Plenum Press, New York (1978).

125. Walford R. L., Liu R. K., Mathies M., Gerbase-Delima M., Smith G. S. Mech. Age Dev, 2, 447–454 (1974).

126. Waller C. S., Claman H. N. J. Immunol, 115, 1438–1443 (1975).

127. Warr G. W., Marchalonis J. J. Quart. Rev. Biol, 53, 225–241 (1978).

128. Weigert M., Gatmaitan L., Loh E., Schilling J., Hood L. Nature, 276, 785–790 (1978).

129. Wigzell H., Stjemsward J. J. Natl. Cancer Inst, 37, 513–517 (1966).

130. Yoshiid T., Mellors R. C., Strand M., August J. T. J. exp. Med, 140, 1011–1027 (1974).

131. Yunis E. J., Fernandes G., Stutman O. Amer. J. Clin. Pathol, 56, 280–292 (1971).

132. Yunis E. I., Fernandes G., Teague P. O., Stutman O., Good R. A. In: Tolerance, Autoimmunity and Aging (M. M. Siegel and R. A. Good, Eds.), 62-119, Charles C. Thomas, Springfield (1972).

133. Yunis E. J., Greenburg L. J. Fed. Proc, 33, 2017–2019 (1974).

134. Yunis E. J., Martinez C., Good R. A. Nature, 204, 850–853 (1964).

135. Zukposki C. F., Killen D. A, Ginn E., Matter B., Lucas D. O., Seigler H. F. Transplantation, 9, 71–74 (1970).

Глава 8. Старение клетки

Введение

Простейшие одноклеточные организмы подвержены старению, т. е. старение может быть клеточным феноменом. Высокоорганизованные многоклеточные организмы также стареют; их старение обусловлено старением индивидуальных клеток. В то же время причина старения многоклеточных организмов может отличаться от причины старения одноклеточных; не исключено, что она связана с более высоким уровнем организации — тканевым или организменным. С развитием методов выделения отдельных клеток из тканей и созданием условий для их роста и длительного размножения in vitro стало возможным изучать поведение клетки в отсутствие влияния внутренней среды организма. Рост, деление и метаболизм клеток можно изучать в культуре, однако следует помнить, что условия in vitro не соответствуют физиологическим и свойства клеток могут оказаться измененными. Таким образом, если эти исследования in vitro и дают некоторую полезную информацию о самой клетке, то они имеют лишь ограниченную ценность, когда речь идет о старении организма в целом. Эти ограничения частично преодолеваются, если использовать метод, трансплантации клеток и тканей животных определенного (возраста реципиентам другого возраста с последующим изучением старения клеток донора. В подобных условиях клеткам донора обеспечивается естественное окружение. Ниже анализируются оба метода и получаемые с их помощью сведения.

Старение клеток in vitro

Ранние исследования клеток в культуре были выполнены на фибробластах куриного эмбриона. Эбелинг [14], работавший вместе с Алексисом Каррелем, первый сообщил, что фибробласты непрерывно размножаются в среде, содержащей экстракт клеток цыпленка. Это наводило на мысль, что клетки, освобожденные от физиологического контроля, могут жить неопределенно долго, т. е. стать бессмертными, и что их ограниченная продолжительность жизни зависит от факторов, присущих организму. Однако результаты этой работы не удалось воспроизвести современными методами культивирования. По-видимому, непрерывное размножение фибробластов было вызвано внесением в среду вместе с экстрактом свежих клеток [24]. Позже было установлено, что клетки в культуре иногда приобретают патологические черты — у них меняется число хромосом, и именно такие клетки способны непрерывно делиться. Отсюда следует важный вывод о необходимости периодической проверки культуры для того, чтобы вовремя выявить клетки с измененным кариотипом, которые ведут себя подобно раковым.

Позже Каррель и Эбелинг [4] сообщили, что скорость роста куриных фибробластов обратно пропорциональна возрасту цыпленка, плазму которого использовали для культивирования. Результаты этой работы тоже не подтвердились, но в других исследованиях было показано, что латентный период миграции клеток из эксплантатов длиннее, если использовались ткани старых доноров [5]. Это наблюдали и другие авторы.

Культура клеток in vitro

Методы культуры ткани были значительно усовершенствованы за последние 20 лет, и сейчас можно изучать клетки в условиях, очень близких к физиологическим. Ткань изолируют и обрабатывают трипсином, разрушающим межклеточное вещество и освобождающим клетки, которые затем собирают центрифугированием. Известное число клеток помещают в стеклянные или пластиковые культуральные сосуды, содержащие среду, и инкубируют при 37 °C. При культивировании in vitro фибробластов легкого и кожи человека наблюдаются при четко различимые фазы. Через несколько часов после посева клетки прилипают к стеклянной поверхности и по прошествии 24–48 ч начинают делиться. Поверхность стекла через несколько дней покрывается дочерними клетками. Так образуется первичная культура. Период времени от высева исходных клеток до завершения образования монослоя называется фазой I.

После образования монослоя скорость деления клеток значительно уменьшается. Для получения больших количеств клеточной массы необходимо создать условия для дальнейшего роста клеток; Сначала удаляют среду, а затем добавляют трипсин, после чего клетки отстают от стекла. Часть суспензии клеток помещают в новые культуральные флаконы, на свободной поверхности которых клетки возобновляют деление. Обычно используют флаконы с одинаковой поверхностью. Если в этих условиях количество клеток, выращенных в двух новых флаконах, в 2 раза превышает их число в первичной культуре, т. е. происходит одно удвоение клеточной популяции, то принято обозначать частоту субкультивирования отношением 1:2. Точно неизвестно, делится ли один раз каждая клетка или только некоторые. При частоте субкультивирования 1:4 клеточная масса увеличивается в 4 раза, т. е. популяция удваивается дважды. Обычно, когда субкультивирование проводится с частотой 1:2, удвоение популяции достигается каждые 3–4 дня и за пять недель получают 210 (1024) дочерних клеток.

Фибробласты легких и кожи человека быстро делятся и растут, если материалом для пересева служит суспензия клеток первичной культуры, которая прошла фазу I. Популяция эмбриональных клеток удваивается 40–60 раз. Это соответствует фазе II, которая характеризуется быстрым ростом клеток. Иногда в этой фазе может появиться несколько клеток, которые начинают непрерывно делиться. Поэтому желательно время от времени исследовать кариотип клеток. Любое отклонение кариотипа от исходного указывает на наличие трансформированных или раковых клеток. Однако, как правило, пролиферация клеток постепенно затухает после 40–60 удвоений популяции и полностью прекращается примерно после 50±10 удвоений популяции, после чего клетки разрушаются и погибают. Это фаза III, для которой характерно снижение пролиферации и развитие признаков старения клеток. Клетки этой фазы называются поздними пассажными клетками. Клетки стареют даже в том случае, если регулярно заменяется среда и питательные вещества имеются в достаточном количестве. В фазе III время образования монослоя становится больше, чем в фазе II, постепенно оно увеличивается еще больше, клетки перестают делиться и затем погибают (рис. 8.1).

Рис. 8.1. Диаграмма происхождения клеточных штаммов и феномена трансформации клеток в культуре [26]. Фаза I, первичная культура, завершается формированием первого монослоя. Фаза II характеризуется усиленным ростом, требующим частых пересевов. Когда культура достигает этой фазы, ее называют 'клеточным штаммом'. В результате какого-либо изменения может возникнуть клеточная линия с неограниченной продолжительностью жизни или клетки вступают в фазу III и погибают

Кроме снижения пролиферативной активности клеток в фазе III (рис. 8.2) изменяются некоторые метаболические параметры (табл. 8.1). Содержание одних ферментов снижается, других — повышается или остается прежним. Эти изменения сходны с теми, которые наблюдаются в различных органах животного in vivo при старении (гл. 3). Момент снижения пролиферативной активности легко регистрируется и принимается обычно за начальную точку фазы III, правда, некоторые изменения метаболических параметров возникают раньше уменьшения скорости деления. Несомненно, что репликация зависит от интенсивности метаболизма, снижение которой не может не отразиться на способности клеток к пролиферации. Холлидей иТаррент [28], а также Линн и др. [35] сообщили, что на поздних этапах фазы III легочные фибробласты человека MRC-5 содержат измененную ДНК-полимеразу, имеющую аминокислотные замены. По-видимому, именно этим объясняется уменьшение пролиферативной активности клеток. Оргел [39] предположил, что в ДНК-полимеразе старых клеток могут возникать ошибки, которые отрицательно сказываются на скорости деления. В структуре некоторых других ферментов, изученных к настоящему времени (в их числе РНК-полимераза), ошибки не обнаружены; это свидетельствует о том, что аминокислотные последовательности данных ферментов не изменяются при переходе клеток из фазы II в фазу III [13, 15, 30] (другие ссылки см. в гл. 9). Таким образом, наблюдаемое ослабление пролиферации, по-видимому, обусловлено только постепенным снижением синтеза ДНК-полимеразы.

Рис. 8.2. Зависимость количества клеток штамма WI-44 от длительности культивирования [24]. В течение первых 40 пассажей число клеток остается практически постоянным и составляет около 6·106 на каждый пассаж при частоте субкультивирования 2:1. Начиная с 45-го пассажа, число клеток логарифмически падает (фаза III)

Таблица 8.1. Метаболические и клеточные параметры, которые снижаются, повышаются или не изменяются при старении интактных фибробластов человека in vitro [26]

Возрастные изменения клеток в культуре

С целью исследования причин старения организма было предпринято изучение старения клеток в культуре. Как впервые показали Свим и Паркер [48], фибробласты, полученные из различных тканей человека, пролиферируют только в течение ограниченного времени, после чего погибают. Эти авторы, однако, не выяснили, сохраняют ли клетки в культуре свои нормальные свойства, и не осмелились предположить, что их ограниченная пролиферативная активность связана со старением. Позже аналогичные работы были широко развернуты в лаборатории Хейфлика. Хейфлик и Мурхед [27] установили, что легочные фибробласты эмбриона человека проходят в культуре около 50 удвоений популяции и затем погибают. Фибробласты, полученные из легочной ткани взрослого донора, подвергаются только ~20 удвоениям популяции [24]. Хейфлик предположил, что имеется обратная зависимость между возрастом донора и пролиферативным потенциалом фибробластов. Позже другие исследователи [18, 34, 37, 43, 45] также сообщили о наличии такой связи (рис. 8.3). Более того, было показано, что при культивировании фибробластов кожи, полученных от людей в возрасте 10–90 лет, наблюдается снижение потенциала удвоения примерно на 0,20 относительные единицы в расчете на каждый год жизни донора. Коэффициент регрессии составляет -0,20 [37]. Сообщение Голдстейна и др. [19] о том, что не хронологический возраст донора, а скорее его физиологическое состояние ответственно за скорость роста фибробластов, побудило многих авторов проделать скрупулезную работу с клетками разных типов, чтобы установить, действительно ли существует линейная связь между хронологическим возрастом и удвоением популяции. Изучение культур фибробластов, источником которых служили клетки тщательно отобранных здоровых доноров, не предрасположенных к диабету, дало отрицательный результат: обратная зависимость между возрастам донора и числом удвоений популяции не была обнаружена. В то же время эта зависимость была установлена для культур клеток, полученных от больных диабетом или от лиц, генетически предрасположенных к этому заболеванию. Таким образом, именно физиологическое состояние в большей степени, чем хронологический возраст, определяет пролиферативную активность клеток.

Рис. 8.3. Зависимость максимального числа удвоений популяции фибробластов человека от возраста донора [37]. Средние значения для каждого десятилетия обозначены горизонтальными черточками. Коэффициент линии регрессии составляет -0,20 (±0,5 S.D) клеточных удвоений в год; коэффициент корреляции равен 0,5

Можно ожидать, что фибробласты больных прогерией (синдром Хатчинсона — Гилфорда) и с синдромом Вернера, заболеваниями, для которых характерно ускоренное старение, должны иметь сниженную пролиферативную активность. Прогерия — редкое генетическое заболевание человека, при котором наблюдается замедление роста и атеросклероз всех крупных кровеносных сосудов, включая аорту и коронарную артерию, уже в 9-летнем возрасте [40], а также значительное отложение возрастного пигмента липофусцина в клетках многих органов. Картина преждевременного старения выражена очень ярко, и ребенок в возрасте 9 лет напоминает 70-летнего человека. Больные остаются бесплодными и умирают, не достигнув 20 лет. Синдром Вернера является сходным заболеванием, но его симптомы развиваются позже; больные тоже имеют сниженную продолжительность жизни, в среднем около 47 лет. Заболевание носит генетический характер, оно контролируется аутосомным генам. Основные симптомы: высокая частота злокачественных новообразований, ранняя потеря и поседение волос, малый рост, юношеская катаракта, склонность к диабету, ранний атеросклероз, кальцификация кровеносных сосудов и остеопороз.

Фибробласты, полученные от 9-летних больных прогерией, проходят в культуре только 2–4 удвоения популяции, т. е. существенно меньше, чем клетки, полученные от здоровых детей того же возраста. Снижен синтез ДНК и эффективность клонирования [16, 17]. Антигенные маркеры HLA, имеющиеся на поверхности фибробластов здоровых людей, отсутствуют на фибробластах больных прогерией. Фибробласты больных с синдромом Вернера также обладают сниженным потенциалом удвоения [37]. Эти данные показывают, что скорее физиологическое состояние, а не хронологический возраст определяет способность клеток к пролиферации [19]. Более того, ускоренное старение организма отражается в ускоренном старении клеток in vitro, о чем свидетельствует изменение скорости деления и метаболизма.

Известно, что если клетки заморозить при температуре ниже нуля после того, как они просуществовали в культуре некоторое время, например прошли 20 удвоений популяции, а затем вернуть их к жизни при 37 °C, то они возобновляют деление и "доживают свой век", проходя еще около 30 удвоений популяции. Это указывает на постоянство потенциала деления клеток данного типа, который не зависит от времени, необходимого для завершения полного цикла делений. Фибробласты человека штамма WI-38, замороженные в жидком азоте на 14 лет, после возобновления размножения завершили общий цикл деления, который составил 50±10 удвоений популяции [25].

Был измерен потенциал деления клеток различных типов. Мартин и др. [37] показали, что фибробласты кожи эмбриона человека проходят 45 удвоений популяции, тогда как клетки скелетной мышцы и костного мозга — значительно меньше. Кроме того, выяснили, что клетки почки, сердца, тимуса, щитовидной железы [27] и печени [34] живут в культуре меньше, чем клетки легкого. Следовательно, пролиферативная активность клеток различных типов неодинакова. Зависит ли это от характера и степени их дифференцировки, пока неизвестно. Хотя клетки костного мозга и эпителия продолжают делиться в организме на протяжении всей жизни, их пролиферативная способность in vitro ограничена. В этой связи было бы важно узнать не только то, почему эти клетки имеют пониженный потенциал деления, но также и то, не делились ли они уже до помещения их в культуру. Такие исследования могут дать полезную информацию о том, почему клетки типа нейронов, скелетной и сердечной мышц прекращают деление на ранней стадии развития.

Были предприняты попытки установить взаимосвязь между продолжительностью жизни вида и потенциалом деления фибробластов, и хотя были изучены лишь немногие виды с разной продолжительностью жизни, результаты указывают на наличие положительной корреляции между этими величинами (табл. 8.2). Фибробласты эмбриона галапагосской черепахи, наиболее долгоживущего вида среди изученных, обладают и самым высоким потенциалом деления, тогда как для мыши, чья продолжительность жизни не превышает трех лет, эта величина значительно меньше.

Таблица 8.2. Максимальная продолжительность жизни культивируемых нормальных фибробластов эмбриона человека и животных [26]

Для ответа на вопрос, вызваны ли старение и смерть клеток накоплением какого-либо цитоплазматического фактора, был использован метод гибридизации соматических клеток [53]. Гибридизация старых и молодых клеток была нежелательна, так как она привела бы к образованию гибридов с двойным набором хромосом. Удалением ядра из легочных фибробластов человека, находившихся во II и III фазах роста, получали цитопласты. Затем происходило их слияние с интактными фибробластами раннего и позднего пассажей следующим образом: молодые цитопласты — с молодыми клетками, старые цитопласты — с молодыми клетками, молодые цитопласты — со старыми клетками и старые цитопласты — со старыми клетками. Число удвоений популяции первых двух гибридных линий составило около 20, а двух последних — около 5. Отсюда следует, что цитоплазма, вероятно, не содержит никакого фактора, который влияет на потенциал деления, т. е. пролиферативная активность клеток определяется на уровне ядра или генома. Полученные результаты необходимо подтвердить в дальнейших исследованиях.

Таким образом, клетки стареют как in vivo, так и in vitro. Существует, однако, большая вариабельность продолжительности их жизни и числа делений. Клетки типа нейронов или скелетной и сердечной мышц прекращают деление in vivo на ранних стадиях развития и становятся постмитотическими. Было бы интересно узнать, сколько раз они подвергаются делению, прежде чем достигают постмитотической стадии. Спустя некоторое время эти постмитотические клетки стареют и погибают. Таким образом, эти клетки сначала прекращают деление, а затем подвергаются старению. Клетки костного мозга, эпителия и печени сохраняют пролиферативную активность в течение всей жизни, хотя она постепенно падает в старческом возрасте. Когда эти клетки культивируют iv vitro, они прекращают делиться и через некоторое время стареют. Очевидно, эти клетки обладают способностью к размножению, которая во много раз превышает аналогичную способность нейронов и мышечных клеток. Важно изучить клетки эмбриона тотчас после того, как они прошли дифференцировку и превратились в клетки специфических типов, чтобы увидеть, имеют ли степень и тип дифференцировки какую-либо связь с пролиферативной активностью и природой постмитотического состояния. Такие исследования клеток различных типов, начиная с самых ранних стадий дифференцировки и до прекращения деления, могут дать ключевую информацию о причинах прекращения деления.

Возникает вопрос, действительно ли те клетки, которые сохраняют способность делиться в течение всей жизни, не стареют? Действительно ли они обновляются всякий раз, когда делятся? Можно ли считать две дочерние клетки полностью идентичными не только в отношении содержания ДНК, но и родительских органелл? Известно, что во время созревания сперматиды наблюдается неадекватное деление.

Вернет [3] предположил, что клетки одного типа могут быть более ответственны за старение, чем другие. По его мнению клетки тимуса и тимус-зависимые клетки, которые подвержены ослаблению пролиферации по типу фазы III, определяют темп старения. Вернет — сторонник той точки зрения, что изменения в этих клетках ответственны за аутоиммунные заболевания, которые чаще встречаются в пожилом возрасте. Эта концепция основана на представлении, что причиной старения являются соматические мутации, однако доказательств для нее пока нет.

Если старение — внутреннее свойство клеток, тогда оно должно быть присуще и одноклеточным организмам. Амебы проходят ограниченное число делений и живут ограниченное время, если их содержать на неполноценном рационе. Они продолжают расти и размножаться непрерывно только в том случае, если питание обильно, чего обычно не бывает в естественных условиях [38]. Многие клоны парамеций [46, 47] и аскомицетов [41] имеют ограниченную пролиферативную активность.

Старение клеток in vivo и после трансплантации

Клетки некоторых типов стареют in vivo после немногочисленных делений, другие — после большого числа делений. Различия зависят от степени дифференцировки клеток, их окружения и питания. Ограниченная жизнеспособность клеток может быть следствием снижения функциональной активности и старения организма в целом. Нельзя ли избежать старения и надолго сохранить клетки живыми путем переноса их молодому хозяину? Вместе с тем, если клетки организма постоянно замещать клетками более молодого индивидуума, не сделает ли это его жизнь более продолжительной или бесконечной? Трансплантация клеток молодому хозяину обеспечивает им естественное физиологическое окружение, которое нельзя создать при культивировании вне организма. Поэтому опыты по трансплантации позволяют отчасти отклонить упреки по поводу неестественного окружения клетки при культивирований in vitro и неприменимости полученных этим способом результатов к процессу старения организма.

Старение клеток in vivo

Ранние работы по старению клеток in vivo были проведены на интактных объектах. Уайтли и Хортом [50] нашли, что число митотических фигур на единицу поверхности клеток эпидермиса уха мыши составило 30, 15 и 2–6 в возрасте 9 дней, 3 дней и 33–36 мес (старые мыши) соответственно. Трашер и Гройлих [49], изучая радиоавтографически пролиферативную активность клеток двенадцатиперстной кишки мышей в возрасте 10, 30–70, 380–390 и 579–638 дней (старые мыши), обнаружили, что продолжительность клеточного цикла с возрастом увеличивается (табл. 8.3). Преимущественно увеличивалась продолжительность G1-фазы, тогда как фаза синтеза ДНК (S-фаза) не изменялась. Эти исследования ясно показывают, что, хотя клетки некоторых типов сохраняют способность к пролиферации вплоть до очень старого возраста, их активность существенно снижается.

Таблица 8.3. Время митотического цикла клеток обкладочного эпителия крипт тонкого кишечника мышей линии BCF1 в различном возрасте [2]

1) TC, TG1, TS, TG2 и ТM — соответственно продолжительность (в часах) клеточного цикла, фаз G1, S, G2 и митоза.

Такое явление, как смерть клетки, встречается не только в старческом возрасте или в фазе III при культивировании, клетки гибнут и в период раннего развития. Жабры и хвост головастика, предпочка и первичная почка высших позвоночных элиминируются в период раннего развития вследствие отмирания клеток этих органов [42]. Образование и формирование пальцев конечностей у позвоночных также сопровождается процессами гибели и резорбции клеток [51]. При метаморфозе, т. е. превращении личинки насекомого во взрослую особь, наблюдается массовое отмирание клеток органов личинки. Следовательно, гибель клеток в период развития необходима для образования совершенных и функционально активных органов взрослых особей, она своевременна и наступает на соответствующих стадиях развития, т. е. и здесь однажды сформированные клетки стареют и умирают.

Старение клеток после трансплантации

У насекомых с полным превращением, например у дрозофилы, на определенных участках эмбриона расположены группы специализированных клеток — имагинальные диски. Клетки каждого диска предназначены для дифференцировки специфического типа, т. е. превращения в определенный орган. Когда имагинальный диск эмбриона пересаживают в полость тела личинки того же вида, эти клетки пролиферируют, но остаются в недифференцированном состоянии до образования куколки. В период окукливания они дифференцируются и превращаются в определенную структуру. После дифференцировки эти клетки не пролиферируют. Если же имагинальный диск пересадить в тело взрослой особи того же вида, то клетки диска делятся, но не дифференцируются до конца жизни хозяина. Если диск извлечь в любом периоде жизни хозяина, разделить на фрагменты и пересадить взрослым особям, то клетки продолжают делиться у реципиента, не дифференцируясь. Используя метод серийных трансплантаций, Хейдорн [20] показал, что клетки имагинального диска сохраняют пролиферативную активность длительное время, во много раз превышающее максимальную продолжительность жизни насекомого. Эти исследования доказали, что, по крайней мере у насекомых, клетки пролиферируют в определенных условиях в течение времени, которое существенно больше продолжительности жизни хозяина. Однако неизвестно, замедляется ли постепенно пролиферативная активность или нет. Имагинальные диски имеются только у насекомых; так как у позвоночных сравнимые эмбриональные структуры отсутствуют, значение этих исследований для старения высших животных остается проблематичным.

С целью изучения процессов старения клеток и тканей производили пересадку тканей мышей одного возраста реципиенту (хозяину) другого возраста. Эти исследования выполнялись на инбредных и сингенных мышах, чтобы по возможности избежать несовместимости тканей. Крои [31, 32] серийно пересаживал кожу тела, уха и хвоста мышей-родителей молодым гибридам F1. Когда хозяин F1 старел, трансплантаты отделяли и пересаживали мышам F2. Такие последовательные переносы лоскутов кожи показали, что ее жизнеспособность и пролиферативный потенциал клеток сохраняются в течение 7–8 лет, что значительно превышает продолжительность жизни мыши. Однако после 5–6 пассажей трансплантат уменьшался в размере, с каждым последующим переносом пролиферация клеток снижалась и в конце концов ткань дегенерировала. Можно сделать вывод, что клетки сохраняют свою жизнеспособность в течение времени, превышающего продолжительность жизни хозяина, а ограничение пролиферативной активности зависит от условий внеклеточного окружения.

Влияние возраста донора на пересаженную ткань было изучено путем трансплантации кожи старой и молодой (возраст 680 и 74 дня) мыши 74-дневному животному [32]. Старая кожа отмирала у молодой мыши через 199–200 дней, но молодая ткань сохранялась дольше, до 300 дней. Хортон [29] пересаживал кожу старых (30–32 мес) мышей молодым (3–4 мес) реципиентам. Трансплантаты переживали более 4 лет, что значительно больше максимальной продолжительности жизни мышей. Следует отметить, что скорость деления клеток трансплантированной ткани была снижена. Это может быть одной из причин ее более длительного выживания.

Клетки кроветворной системы сохраняют высокую пролиферативную способность in vivo, и, по-видимому, это свойство не подвержено возрастным изменениям. Кроветворная ткань содержит стволовые клетки, или клетки-предшественники. Полагают, что каждая стволовая клетка делится, образуя одну стволовую клетку — потомка и дифференцированную клетку. Последняя начинает экспоненциально делиться с образованием клеток, которые имеют малую продолжительность жизни. Стволовые клетки имеют большую продолжительность жизни и сохраняют способность к пролиферации в течение всей жизни животного. Способность этих клеток пролиферировать была исследована посредством серийных пересадок молодым реципиентам, чья кроветворная система была разрушена массивным облучением всего тела (~800 рад). Когда реципиенты старели, трансплантированные кроветворные клетки переносили более молодым облученным реципиентам. Было показано, что защита от последствий облучения, создаваемая пересаженными клетками у реципиента, с каждой пересадкой ослаблялась [1,6]. Это может свидетельствовать об ограниченном пролиферативном потенциале стволовых клеток. В другом исследовании облученным мышам внутривенно вводили живые кроветворные клетки. Через 9-14 дней стволовые клетки образовывали колонии в селезенке хозяина. Каждая колония: развивалась из одной стволовой клетки. Клетки этих колоний были затем серийно пересажены более молодым облученным реципиентам (рис. 8.4). Результаты показали, что число колоний, образующихся в селезенке, снижается с каждой трансплантацией [33, 34]. Даже если согласиться с тем, что пролиферативная активность клеток кроветворной системы снижается после определенного возраста, оставалось необъяснимым влияние больших доз радиации на старение кроветворной системы и организма.

Рис. 8.4. Исследование колониеобразующей активности клеток костного мозга методом серийных трансплантаций облученным реципиентам [44]

Ситуация стала более ясной, когда в качестве реципиентов, кроветворных клеток вместо облученных мышей использовали, животных с генетически детерминированной анемией [21, 22]. Клетки молодых и старых доноров излечивают анемию и одинаково хорошо размножаются в течение 36 мес при четырех последовательных трансплантациях. Однако наблюдается постепенное снижение колониеобразующей активности стволовых клеток, которая регистрируется по числу колоний в селезенке реципиента, причем снижение больше выражено для клеток старых доноров. По-видимому, можно сделать вывод, что кроветворные клетки способны лишь к ограниченному числу делений, хотя они могут делиться в течение времени, превышающего продолжительность жизни мыши.

В другой работе Уильямсон и Асконас [52] иммунизировали мышей-доноров иммуноглобулином G (быка), конъюгированным с динитрофенолом. Иммуноглобулин, вырабатываемый у мышей к этому антигену, очень специфичен, и его можно легко обнаружить. Клетки костного мозга иммунизированных мышей затем трансплантировали реципиентам, иммунная система которых была разрушена интенсивным облучением (рис. 8.4). У реципиентов исследовали продукцию данного иммуноглобулина. Производили серийные пересадки клеток костного мозга от одного поколения мышей другому. После четырех трансплантаций выработка иммуноглобулинов снижалась вследствие постепенного уменьшения скорости деления с каждой последующей пересадкой, хотя кроветворные клетки были функционально активными в течение периода времени, превышающего максимальную продолжительность жизни мышей. В экспериментах Харрисона [21, 22] и Уильям сон а и Асконаса [52] не было установлено, какое влияние на пролиферацию оказывает сама процедура трансплантации и какие факторы в норме способствуют снижению потенциала деления кроветворных клеток.

Опыты по изучению влияния возраста донора на пролиферативную способность кроветворных клеток дали противоречивые результаты. Харрисон и Даблдей [23] иммунизировали молодых и старых мышей эритроцитами барана (SRBC). Клетки костного мозга и селезенки затем серийно пересаживали молодым летально облученным реципиентам и оценивали колониеобразующую активность стволовых клеток в селезенке. Оказалось, что клетки мышей обоих возрастав имеют почти одинаковую способность к образованию колоний. Это противоречит данным Макинодана и др. [36] и Уильямсона и Асконаса [52], которые сообщили об ослаблении иммунной компетентности у мышей с возрастом. Возможно, что эти различия объясняются неодинаковой длительностью интервалов между пересадками.

Дениел и его сотрудники изучили пролиферативную активность эпителия молочной железы при серийных пересадках. Молочную железу реципиента удаляли и на ее место помещали кусочки ткани молочной железы донора размером 0,5 мм. Когда реципиент старился, пересаженную ткань переносили молодым мышам (рис. 8.5). Примерно после семи последовательных пассажей пролиферация эпителиальных клеток уменьшалась, трансплантаты сморщивались и гибли [7-12]. В других опытах было показано, что если промежуток между пересадками равен 3 мес, то трансплантат уменьшается в размерах быстрее и сохраняется только около двух лет. Если, однако, интервал продлить до 1 года, то трансплантат живет в течение шести пассажей (шести лет), хотя и становится меньше.

Рис. 8.5. Схема серийных пересадок ткани молочной железы мышей [10]. Первичные имплантаты получают из одной железы донора и пересаживают в 10–14 жировых подушечек реципиента, освобожденных от железистой ткани (генерация I). Материал для последующих пересадок всегда берут из наиболее активно растущего трансплантата предшествующей генерации. Скорость роста выражают в средних процентах прижившихся трансплантатов данной генерации

Для того чтобы выяснить, какое влияние оказывает возраст донора на рост и пролиферацию ткани молочной железы, производили одновременную пересадку донорского материала, полученного от 3- и 26-месячных мышей, на контралатеральные участки трехмесячным реципиентам [54]. В идентичных условиях ткани были серийно пересажены пяти поколениям мышей, после чего они деградировали и погибали. Причиной отсутствия возрастных различий могла быть девственность старых самок-доноров и связанное с этим функционально неактивное состояние клеток их молочных желез. В обратном эксперименте, при пересадке ткани молочной железы 26- и 3-месячных мышей на контралатеральные участки 26-месячных мышей, ни один трансплантат интенсивно не развивался. На результат этого опыта могло повлиять ухудшение эндокринного статуса, которое наблюдается при старении.

Резюме

Исследования показывают, что эукариотические клетки всех типов подвержены старению и теряют пролиферативную активность после определенного периода in vivo, in vitro и даже после пересадки более молодым реципиентам. Это свойство, вероятно, определяется не цитоплазматическим фактором, а геномом. Следовательно, старение клеток и смерть являются их неотъемлемыми свойствами. Пролиферативная способность клеток различных типов неодинакова, она зависит от типа и степени их дифференцировки. Некоторые клетки превращают деление на ранней стадии развития, а другие продолжают делиться в течение всей жизни. Клетки кожи, кроветворной системы и эпителия молочной железы грызунов сохраняют способность к росту и пролиферации до конца жизни животного. Пересаживая эти ткани молодым реципиентам, можно отсрочить их старение и сохранить жизнеспособность на период времени, больший максимальной продолжительности жизни хозяина. Таким образом, рост и жизнеспособность" клеток можно изменить с помощью некоторых приемов. Эти свойства также, вероятно, определяются физиологическим состоянием животного, а не его хронологическим возрастом. Итак, причиной старения организма является старение клеток.

Литература

1. Barnes D. W. H., Loutit J. F., Micklem H. S. Ann. N. Y. Acad. Sci., 99, 374–385 (1962).

2. Baserga R. L. In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), 101–121, Reinhold, New York (1977).

3. Burnet F. M. Lancet, 2, 358–360 (1970).

4. Carrel A., Ebeling A. H. J. exp. Med., 34, 599–623 (1921).

5. Cohn A. E., Murray H. A. J. exp. Med., 42, 275–290 (1925).

6. Cudkowicz G., Upton A. C., Shearer G. M., Hughes W. L. Nature, 201, 165–167 (1964).

7. Daniel C. W. Adv. Gerontol. Res., 4, 167–199 (1972).

8. Daniel C. W. Experientia, 29, 1422–1424 (1973).

9. Daniel C. W. In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayfick, Eds.), 122–158, Reinhold, New York (1977).

10. Daniel C. W., Aidells B. D., Medina D., Faulkin L. J., Jr. Proc. F.A.S.E.B… 34, 64–67 (1975).

11. Daniel C. W., DeOme K. B., Young J. T., Blair P. B., Faulkin L. J. Proc. nat Acad. Sci., USA, 61, 53–60 (1968).

12. Daniel C. W., Young J. T. Expl. Cell Res., 65, 27–32 (1971).

13. Dreyfus J. C., Rubinson H., Schepina F., Weber A., Marie J., Kahn A. Gerontology, 23, 211–218 (1977).

14. Ebeling A. H. J. exp. Med., 17, 273–285 (1913).

15. Evans C. H. Differentiation, 5, 101–105 (1976).

16. Goldstein S. Lancet, 1, 424 (1969).

17. Goldstein S. New Eng. J. Med., 285, 1120–1129 (1971).

18. Goldstein S., Littlefield I. W., Soeldner J. S. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 64, 155–160 (1969).

19. Goldstein S., Moerman E. J., Soeldner J. S., Gleason R. E., Barnett D. M. Science, 199,781–782 (1978).

20. Hadorn E. In: Major Problems in Developmental Biology (M. Locke, Ed.)" Academic Press, New York and London (1967).

21. Harrison D. E. Nature (New Biol.), 237, 220–221 (1972).

22. Harrison D. E. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 70, 3184–3188 (1973).

23. Harrison D. E., Doubleday J. W. J. Immunol., 114, 1316–1322 (1975).

24. Hayflick L. Expl. Cell Res., 37, 614–636 (1965).

25. Hayflick L. New Eng. J. Med., 295, 1302–1308 (1976).

26. Hayflick L. In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), 159–186, Reinhold, New York (1977).

27. Hayflick L., Moorhead P. S. Expl. Cell Res., 25, 585–621 (1961).

28. Holliday R., Tarrant G. M. Nature, 238, 26–30 (1972).

29. Horton D. L. J. Gerontol., 22, 43–45 (1967).

30. Kahn A., Guillouzo A., Cottreau D., Marie J., Bourel M., Bovine P., Dreyfus J. C. Gerontology, 23, 174–184 (1977).

31. Krohn P. L. Proc. Roy. Soc. (B), 157, 128–147 (1962).

32. Krohn P. L. In: Topics of the Biology of Aging (P. L. Krohn, Ed.), 125–138, John Wiley, New York (1966).

33. Lajtha L. G., Schofield R. Adv. Gerontol. Res., 3, 131–146 (1971).

34. LeGuilly Y., Simon M., Lenoin P., Bowrel M. Gerontologia, 19, 303–313 (1973).

35. Linn S.t Kairis M., Holliday R. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 73, 2818–2822 (1976).

36. Makinodan T., Perkins E. H., Chen M. G. Adv. Gerontol. Res., 3, 171–198 (1971).

37. Martin G. M., Sprague C. A., Epstein C. J. Lab. Invest., 23, 86–92 (1970).

38. Muggleton A., Danielli J. F. Expl. Cell. Res., 49, 116–120 (1968).

39. Orgel L. Nature, 243, 441–445 (1973).

40. Reichel W., Garcia-Bunuel R., Dilallo J. J. Amer. Geriat. Soc, 19, 369–375 (1971).

41. Rizet G. C. R. Acad. Sci. (Paris), 237, 838 (1953).

42. Saunders J. W., Jr. Science, 154, 604–612 (1966).

43. Schneider E. L., Mitsui Y. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 73, 3584–3588 (1976).

44. Siminovitch L., Till J. E., McCulloch E. A. J. Cell. Сотр. Physiol., 64, 23–32 (1964).

45. Smith J. R., Pereira-Smith O. M., Schneider E. L. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 75, 1353–1356 (1978).

46. Smith-Sonneborn J., Klass M., Cotton D. J. Cell Sci., 14, 691–699 (1974).

47. Sonneborn T. M. Biol. Bull., Woods Hole, 74, 76–82 (1938).

48. Swim H. E., Parker R. F. Am. J. Hyg., 66, 235–243 (1957).

49. Thrasher J. D., Greulich R. C. J. exp. Zool., 159, 39–46 (1965).

50. Whiteley H. J., Horton D. L. J. Gerontol., 18, 335–339 (1963).

51. WhittenJ. M. Science, 163, 1456–1457 (1969).

52. Williamson A. R., Askonas B. A. Nature, 238, 337–339 (1972).

53. Wright W. E., Hayflick L. Fed. Proc, 34, 76–79 (1975).

54. Young L. J. T., Medina D., DeOme K. B., Daniel C. W. Expl. Gerontol., 6, 49–56 (1971).

Глава 9. Теории старения

Введение

Структурные и функциональные изменения возникают на всех уровнях организации — молекулярном, клеточном, тканевом и на уровне целого организма — в любом организме в течение всей его жизни. Изменения, которые появляются после достижения половой зрелости, составляют феномен старения. Теоретически причина старения может быть связана с: любым уровнем организации. Все теории старения имеют некоторую ценность для понимания механизма старения, однако необходимо провести грань между первичными и вторичными, причинами этого явления. Поскольку теории основаны на наблюдаемых или вероятных изменениях структуры и функции на различных уровнях организации, необходимо вначале выяснить, являются ли эти изменения первопричиной старения или они — результат изменений, которые могут возникать на другом, более важном уровне.

Все многоклеточные организмы обладают двумя поразительными универсальными свойствами: 1) после достижения, половой зрелости у них постепенно снижается способность к адаптации, 2) все представители вида имеют более или менее постоянную продолжительность жизни. Крысы, мыши и Drosophila, которых содержат в контролируемых условиях, живут в течение времени, характерного для данного вида и линии. Очевидно, эти два универсальных свойства являются наследуемыми и контролируются генетически.

Кроме того, замечено также, что время, необходимое для достижения половой зрелости, одинаково у всех представителей вида, например 10 нед у крыс, 12 лет у человека. Репродуктивный период у всех представителей вида или линии тоже более или менее одинаков. Различные фазы развития, приводящие к репродуктивной зрелости, точно выдержаны во времени. Вероятно, изменения, возникающие во время развития, находятся под генетическим контролем и возникают в соответствии с генетической программой.

Для объяснения механизма старения на уровне гена, который является первоисточником всей информации в организме, разработано несколько теорий. В этих теориях ген расценивают как первичный участок, в котором могут возникать изменения, инициирующие процесс старения, хотя такие факторы, как температура, влажность, питание и стресс, также способны влиять на скорость старения. Теории, которые основаны на изменении содержания ферментов и гормонов, на перекрестном связывании макромолекул, накоплении возрастного пигмента, проницаемости мембран, изменениях в различных органеллах типа лизосом и митохондрий, а также на изменении гомеостаза, принимают во внимание явления, вторичные по природе, так как все они могут возникать прямо или косвенно в ответ на изменения ферментов, содержание которых контролируется главным образом генами. Например, изменения содержания ферментов, принимаемые за функцию возраста, могут быть вызваны преимущественно изменениями в транскрипции соответствующих генов, хотя определенную роль здесь играют также изменения в трансляции мРНК или скорости деградации ферментов. Гормональные сдвиги зависят от содержания ферментов, ответственных за синтез гормонов, который в свою очередь контролируется специальными генами. Усиление в пожилом возрасте перекрестного связывания макромолекул может отражать уменьшение скорости их обмена, которая зависит от уровня катаболических ферментов. И сами ферменты, участвующие в перекрестном связывании, могут изменяться при старении. Накопление старческого пигмента липофусцина может быть следствием снижения его экскреции или скорости распада побочных продуктов метаболизма. Изменение проницаемости мембран, возможно, обусловлено нарушением их фосфолипидного состава, а синтез и деградация фосфолипидов осуществляются при участии ферментов. Изменения содержания пермеаз и других белков мембраны могут появиться вслед за изменениями экспрессии генов, ответственных за их синтез. Расстройства гомеостаза происходят как во внутри-, так и во внеклеточных пространствах. События, составляющие этот процесс, регулируются главным образом гормонами и ферментами. Таким образом, указанные сдвиги являются всего лишь вторичными по отношению к изменениям, которые могут возникать на уровне генома.

Прежде чем обсуждать различные теории, которые пытаются объяснить старение на генетическом уровне, уместно рассмотреть некоторые черты старения, указывающие на участие в этом процессе генов. Хотя проявления и следствия разрушительных изменений могут различаться у разных видов живых существ, общим результатом является увеличение восприимчивости организма к различным болезням и вероятности смерти. В пределах данного класса разрушительные изменения у всех его представителей выглядят сходно, правда, их скорость может быть различной. Это хорошо видно на примере млекопитающих. Хотя максимальная продолжительность жизни человека примерно в 50 раз выше, чем у насекомоядного Sorex futneus (продолжительность жизни около 2 лет), картина возрастных изменений у тех и других более или менее одинакова, но у последних возрастные изменения происходят быстрее.

Другая важная особенность состоит в том, что в пределах вида все особи живут в течение приблизительно одинакового периода времени в данных условиях существования. Например, лабораторные крысы живут 3 года, дрозофила — 30 дней. Максимальная продолжительность жизни человека составляет около 100 лет. Эта величина является потенциалом выживания видов. Однако не все представители вида в естественных, неконтролируемых или меняющихся условиях достигают максимального возраста. Средняя продолжительность жизни заметно меньше максимальной. Например, хотя из данных статистики известно, что максимальная продолжительность жизни человека составляет около 100 лет, средняя продолжительность жизни в США к началу 20-го столетия была равна только 48 годам. С тех пор она постоянно увеличивается и в-1975 г. достигла 72 лет (см. рис. 1.3). Это вызвано преимущественно победой над инфекционными заболеваниями, ставшей возможной благодаря успехам биологической и медицинской наук, и снижением детской смертности

Другой фактор, который указывает на генетическую основу старения и продолжительности жизни, состоит в том, что потомки долгожителей имеют продолжительность жизни большую, чем средняя [102, 103]. Средняя продолжительность жизни у женщин больше, чем у мужчин. В США, Швеции и других развитых странах средняя продолжительность жизни женщин составляет 75–78 лет, а мужчин — 70–72 года. Половые различия по продолжительности жизни имеются и у животных: домашней мухи (самцы-18 дней, самки — 30), дрозофилы (самцы — 31 день, самки — 33), белой крысы (самцы — 483 дня, самки — 800) [102]. Инбридинг в короткоживущих, среднеживущих и долгоживущих линиях Drosophila melanogaster доказывает справедливость представлений о генетической основе различий продолжительности жизни у этих насекомых. Более того, продолжительность жизни идентичных близнецов одинакова [102].

В этой связи время развития и протяженность репродуктивной фазы столь же важны, как и длительность периода старения. По крайней мере у млекопитающих существует, по-видимому, положительная корреляция между временем, необходимым для достижения половой зрелости, и максимальной продолжительностью жизни [6, 57] (табл. 1.1). У вида Homo sapiens, который среди млекопитающих живет дольше всех, самый длинный период развития; у индийского слона, лошади и крупного рогатого скота период развития соответственно короче. Однако существуют исключения, особенно среди мелких животных. Эти исключения могут быть примерами адаптивных изменений, которые возникают в особых условиях обитания. У всех млекопитающих, а также у большинства других видов животных репродуктивный период занимает значительную часть жизни и сменяется пострепродуктивным периодом. Однако среди беспозвоночных и низших животных имеются случаи смерти вскоре после единственного акта размножения; таковы тихоокеанский лосось (Onchorhynchus), угорь, речная минога, небольшие однолетние рыбы и осьминог (Octopus). Вероятно, у этих видов воспроизводство вызывает резкое снижение некоторых важных факторов, которые не восстанавливаются, хотя и являются жизненно необходимыми.

В связи с этим встает вопрос о скорости репродукции, или плодовитости, о продолжительности репродуктивного периода и о продолжительности жизни после достижения половой зрелости. Мелкие млекопитающие типа грызунов, которые обладают высокой плодовитостью, имеют короткую репродуктивную фазу, а также укороченный пострепродуктивный период по сравнению с такими крупными млекопитающими, как слон, лошадь, домашний рогатый скот и человек, у которых скорость воспроизводства много ниже. Вероятно, чем быстрее воспроизводство, тем быстрее потеря определенных важных факторов и тем быстрее развитие разрушительных изменений. Однако черепахи откладывают много яиц, но тем не менее долго живут [116]. Матки общественных насекомых, пчел и термитов, которые отличаются большой плодовитостью, также имеют большую продолжительность жизни.

С вышесказанным связано наблюдение, что среди млекопитающих постепенное увеличение времени достижения половой зрелости происходит параллельно с увеличением максимальной продолжительности жизни. Это особенно очевидно для человекообразных. Во время их эволюции за последние 3 млн. лет максимальная продолжительность их жизни выросла почти в 2 раза со скоростью прироста около 14 лет на 100000 лет [23]. Это возможно только при изменениях в геноме типа мутаций и перегруппировки генов. Вызывают ли генетические изменения, результатом которых является увеличение продолжительности жизни, сокращение плодовитости, наблюдаемое у этих долгоживущих млекопитающих, или удлинение периода размножения приводит к увеличению продолжительности жизни, неизвестно.

Теперь коснемся проблемы начала и продолжительности старения. Если начало репродуктивного периода определяется для каждого вида более или менее отчетливо, то этого нельзя сказать о начале старения. Если принять время прекращения репродукции за начало старения (хотя установлено, что функциональная способность практически всех органов начинает снижаться гораздо раньше и что скорость репродукции замедляется задолго до ее прекращения), то следует отметить, что у высших млекопитающих период старения увеличивался параллельно с увеличением репродуктивного периода. Фаза старения не дает особых преимуществ, когда речь идет о выживании, сохранении и эволюции вида, и тем не менее эта фаза увеличилась. Не происходит ли это потому, что низкая скорость репродукции оказывает меньшее вредное воздействие на другие жизненные функции, которые, таким образом, дольше сохраняются? К сожалению, достоверных данных, касающихся пострепродуктивной фазы у животных, недостаточно для установления связи между периодами развития и репродукции и периодом старения.

Если даже рассматривать геном в качестве того первичного участка, где возможны перемены после достижения животным половой зрелости, необходимо иметь в виду, что изменения внеклеточного окружения, связанные с температурой, питанием и т. д., существенно влияют на функцию генома. Поэтому у представителей различных видов и популяций наблюдаются колебания во времени начала старения, его скорости и продолжительности пострепродуктивного периода.

Полученные к настоящему времени данные указывают на то, что старение имеет генетическую основу. Рядом авторов разработаны теории, в которых делаются попытки объяснить старение на уровне генома. Ниже мы обсудим теории только этого типа.

Теория соматических мутации

Росс и Скотт [104] первыми сообщили, что крысы, подвергнутые тотальному облучению, слишком слабому, чтобы вызвать какие-либо острые изменения, погибают раньше, чем необлученные контрольные животные. Затем последовали сообщения о том, что у облученных грызунов [26, 44, 108] и людей [128] симптомы старения, и смертность были такими же, как у интактных особей; было отмечено, однако, что частота опухолей у первых была выше. Поэтому предположили, что облучение вызывает ускорение процесса старения. Основываясь на этих данных, Сцилард [122, 123] предложил для объяснения старения "теорию соматических мутаций", согласна которой мутации, возникающие беспорядочно и самопроизвольно, разрушают гены и хромосомы постмитотических клеток в течение жизни организма, постоянно повышая мутационный груз. При увеличении числа мутаций и потере функциональных генов наблюдается снижение синтеза функциональных белков. Смерть клетки наступает тогда, когда мутационный груз превышает критический уровень. В результате число постмитотических клеток уменьшается, а общая функциональная активность организма снижается.

Эта теория была проверена в опытах с мышами Стивенсоном совместно с Кёртисом [118] и Кёртисом [20, 21]. Мышей облучали дозой 400 рад или им вводили химические мутагены типа азотистых аналогов иприта (0,125 мг) и затем определяли их выживание. В регенерирующей печени молодых и старых мышей исследовали также частоту хромосомных аберраций типа нерасхождения сестринских хроматид в митозе и хромосомных разрывов. У мышей из линий с различной продолжительностью жизни вызывали частичный некроз печени введением четыреххлористого углерода и подсчитывали число хромосомных аберраций после фиксации в метафазе под действием колхицина.

Было показано, что а) сокращение жизни после рентгеновского облучения зависит от дозы, б) в регенерирующих клетках печени облученных мышей повышена частота хромосомных аберраций (рис. 9.1), в) азотистые аналоги иприта не оказывают влияния ни на продолжительность жизни, ни на частоту хромосомных аберраций, г) в клетках печени короткоживущих мышей линии A/HEJ (395 дней) накапливается больше хромосомных аберраций, чем у долгоживущих мышей линии C57BL/6J (600 дней; рис. 9.2) [19]. Кёртис [20] далее предположил, что проникающая радиация повреждает постмитотические клетки больше, чем премитотические. В первых мутационные эффекты аккумулируются и клетка не может устранить их, так как она не делится. Во втором случае поврежденная клетка элиминируется и замещается неповрежденной клеткой. Клетки зародышевого пути более устойчивы к повреждению хромосом, благодаря чему возможно сохранение вида.

Рис. 9.1. Кривые выживания мышей после различных воздействий, начиная с 2-месячного возраста [20]. Кривые начинаются через 30 дней после воздействия — срока, достаточного для того, чтобы не учитывать внезапную гибель. Они показывают, что однократные массивные, но не смертельные дозы ядовитых химических веществ не уменьшают продолжительности жизни, тогда как единичные массивные, но не смертельные дозы рентгеновского облучения дают заметный эффект

Рис. 9.2. Сравнение эффекта нейтронного облучения на число хромосомных аберраций в клетках печени мышей и их возрастных изменений [22]. При однократном облучении дозой 192 рад аберрации наблюдаются в среднем) в 56 % клеток (треугольники)

Кларк и Рубин [17] изучили действие рентгеновского излучения на продолжительность жизни бабочки Habrobracon, у которой самки диплоидны, а самцы либо диплоидны, либо гаплоидны. Интактные самцы, как диплоидные, так и гаплоидные, имеют одинаковую продолжительность жизни. Однако гаплоидные особи более чувствительны к проникающей радиации, чем диплоидные. Это показывает, что соматическая мутация не может быть причиной старения; если бы это было так, то диплоидные особи имели бы большую продолжительность жизни, а диплоидные самцы и самки имели бы одинаковую продолжительность жизни. Диплоидные самцы более устойчивы к радиации. Это говорит о том, что повреждение, вызываемое облучением, восстанавливается более эффективно, если число хромосом больше, и что процесс восстановления не зависит от пола. Итак, снижение продолжительности жизни, вызванное радиацией, отличается от естественного старения. Здесь уместно процитировать Хендлера [42]: "Представление о том, что облучение приводит к преждевременному старению, верно наполовину и в широком смысле отражает нечеткость исходного параметра — продолжительности жизни".

Аналогичные наблюдения были проведены Томпсоном и Холлидеем [125] на уровне клеток in vitro. Когда фибробласты легких эмбриона человека (штамм MRC-5) обрабатывают колхицином в течение 3–6 ч, выживающая популяция содержит около 60 % тетраплоидных клеток, которые продолжают делиться. Продолжительность их жизни не отличается от продолжительности жизни диплоидных клеток. Сопоставима и скорость их роста. Если бы причиной смерти клеток было накопление мутаций или генетические дефекты, то тетраплоидные клетки должны были бы обладать большей устойчивостью и имели бы большую продолжительность жизни. Но это не так. Хён и др. [46] также наблюдали, что диплоидные фибробласты кожи человека имеют ту же продолжительность жизни, что и тетраплоидные. Если мутации и вносят свой вклад в процессе старения клеток в культуре, они не проявляют себя, в период активного роста (фаза II) и потому должны быть рецессивными. Возможно, что происходит постепенное увеличение генетического груза рецессивных дефектов, что может в итоге привести к инактивации одного или нескольких необходимых генов обеих гомологичных хромосом. Если это так, то тетраплоидные клетки могли бы противостоять большим повреждениям и имели бы большую жизнеспособность. Если мутации вредны, они вызывают гибель клеток и не аккумулируются. Диплоидные и тетраплоидные клетки, имели бы сходную продолжительность жизни только в том случае, если бы вредные мутации возникали в конце жизни.

Здесь уместно обсудить действие ионизирующей радиации на сперматогонии и виды животных с различной продолжительностью жизни. Сайнекс [114] сообщил, что приблизительная доза LD50 для сперматогониев, человека, мыши и дрозофилы составляет соответственно 50, 450, 500 и 6400 Р. Эти данные противоречат теории соматических мутаций, согласно которой клетки зародышевого пути устойчивы к мутациям, вызываемым ионизирующим излучением. Кроме того, в соответствии с этой теорией долгоживущие виды должны быть более устойчивыми к радиации, тем не менее человек, продолжительность жизни которого соответственно в 50 и 1200 раз больше, чем у мыши и дрозофилы, более чувствителен к радиации.

Уменьшение продолжительности жизни под влиянием облучения наблюдали у мыши [13, 14, 72], человека [110] и дрозофилы [3, 28, 69, 83]. Популяция дрозофилы, подвергнутая облучению дозой около 4500 рад, фактически живет дольше, чем контрольная [119]. Такой же результат получен на безмикробных мышах [127]. Симптомы, появляющиеся у облученных особей со сниженной продолжительностью жизни, отличаются от тех, которые возникают во время естественного старения без облучения. Следовательно, проникающая радиация не ускоряет процесс естественного старения, но вызывает раннюю смерть из-за повышения частоты рака или других болезней. Таким образом, укорочение жизни, вызванное ионизирующей радиацией, может представлять собой неспецифический эффект и быть следствием "радиационного синдрома", который не связан с естественным старением.

Главная трудность в оценке теории соматических мутаций состоит в отсутствии объективных способов измерения скорости накопления этих мутаций в постмитотических клетках. Единственный испробованный путь заключается в оценке смертности, которая может быть вызвана многими факторами. Кроме того, непонятно, почему клетки зародышевого пути более устойчивы к проникающей радиации. Увеличение продолжительности жизни у дрозофилы [119] и мыши [127] после воздействия излучения может быть побочным эффектом, хотя при больших дозах влияние излучения на смертность очевидно. Итак, накопление соматических мутаций не может быть причиной старения.

Следует рассмотреть другой тип изменений в хроматине, а именно повреждение структуры ДНК. Прайс и др. [94] изучали in vitro включение 3Н-тимидина в ДНК головного мозга, печени и сердца мышей различных возрастов при помощи радиоавтографии с использованием ДНК-полимеразы тимуса теленка. Более интенсивное включение наблюдали у старых мышей, что указывает на большую матричную активность ДНК. Авторы предположили, что это может быть вызвано появлением одноцепочных разрывов в ДНК, для ликвидации которых требуется дополнительный репаративный синтез. Кроме того, может иметь место утрата ферментов репарации, и тогда разрывы не восстанавливаются. Это согласуется с результатами Семиса и др. [109], которые обнаружили повышенное включение 3Н-тимидина в ДНК старых мышей. Наличие таких разрывов или повреждений ДНК в пожилом возрасте подтверждается сходными данными по чувствительности ДНК к нуклеазе S1, которая расщепляет одноцепочечные области. Четзанга и др. [16] показали, что ДНК печени старых 20-месячных мышей более чувствительна к нуклеазе S1, чем ДНК молодых (1-15 мес) мышей. Кроме того, было обнаружено, что в градиенте щелочной сахарозы ДНК головного мозга старых мышей осаждается полидисперсно в виде 4 зон, тогда как у молодых мышей осаждение монодисперсное — в виде одной зоны. Под действием нуклеазы S1 ДНК старых мышей распадается на большее число фракций с малой молекулярной массой. Предположение о деградации ДНК при старении строится также на основании данных о снижении транскрипции РНК хроматина печени в присутствии РНК-полимеразы [45].

Интенсивность внепланового репаративного синтеза ДНК в фибробластах после ультрафиолетового облучения была изучена Хартом и Сетлоу [43]. В фибробластах долгоживущих млекопитающих повреждения восстанавливались с большей скоростью, чем в фибробластах короткоживущих. Установлена линейная связь между логарифмом продолжительности жизни видов и интенсивностью включения 3Н-тимидина в их ДНК, т. е. большая продолжительность жизни может быть обусловлена более эффективной репарацией ДНК (рис. 9.3) [43]. Литтл [74] также сообщил, что репаративная способность ДНК снижена на поздних пассажах культивируемых фибробластов. Эти исследования, однако, не объясняют, почему репаративная активность ДНК снижается в пожилом возрасте или почему она больше у долгоживущих видов. Если это вызвано снижением уровня ферментов репарации, то необходимо знать причину этого снижения. Итак, имеется достаточно доказательств для утверждения, что старение не вызывается соматическими мутациями, возникающими в результате действия проникающей радиации и других экзогенных факторов.

Рис. 9.3. Зависимость между продолжительностью жизни и интенсивностью включения нуклеотида, содержащего изотоп, в ДНК фибробластов в стандартных условиях в ходе репарации после ультрафиолетового облучения [43]

Теория ошибок

Оргел [88] предложил теорию ошибок, согласно которой ошибки, появляющиеся при передаче информации на этапах транскрипции и трансляции, могут вызвать накопление дефектных белков и привести к старению. К числу ошибок относится включение неправильных нуклеотидов в мРНК во время транскрипции, что может приводить к изменению триплетных кодонов, или включение неправильных аминокислот во время трансляции, из-за чего белки частично или полностью инактивируются. Ошибки в белках, которые сами участвуют в белковом синтезе, таких, как ферменты транскрипции и трансляции, особенно усиливают процесс накопления ошибок в клетках. Эти ошибки могут саморазмножаться, вызвать экспоненциальное увеличение дефектных ферментов и белков и привести к "катастрофе ошибок", следствием которой будет старение и смерть клетки.

Накопление ошибок в ферментах, ответственных за метаболизм, может и не привести к повреждениям, так как эти ферменты имеют короткий период полужизни, вскоре деградируют и ошибка ликвидируется. Если, однако, ошибка появляется в молекуле РНК-полимеразы или аминоацил-тРНК — синтетазы, то это может быть причиной включения неправильных аминокислот во все виды белков, которые синтезирует клетка. Тогда уровень дефектных белков будет экспоненциально нарастать. Например, дефектная РНК-полимераза может способствовать появлению нескольких ошибочных нуклеотидов в мРНК различных типов, из-за чего могут появиться изменения в кодонах. Дефектная аминоацил-тРНК — синтетаза может нагрузить тРНК ошибочной аминокислотой, которая включится в белок вместо другой аминокислоты. Теория ошибок основана на предположении, что механизм передачи информации может повреждаться. Другими словами надежность, или точность, этого механизма не абсолютны и ошибки, однажды возникшие в ферментах белкового синтеза, могут распространяться.

Позже Оргел [89] модифицировал свою теорию и постулировал, что, даже если точность механизма синтеза белка не абсолютна и допускает появление ошибок, такие ошибки не обязательно накапливаются, так как последующие генерации белоксинтезирующего аппарата дискретны. Согласно Оргелу, если Cn означает частоту ошибки в n-й генерации белоксинтезирующего аппарата, R — частоту конечной ошибки и α — константу пропорциональности между числом ошибок в синтезирующем аппарате и во вновь синтезированных белках, то

Cn+ 1 = R + αCn.

Если C0= 0, то Cn= R(1 + α + α2 +… αn-1); если а > 1, то С постепенно увеличивается; если а >> 1, то частота ошибки увеличивается по экспоненте и вызывает "катастрофу ошибок".

Однако а может не быть больше 1, и тогда "катастрофа ошибок" не будет неизбежной. В таких случаях достигается постоянная частота ошибки, равная R/(1-α) [90]. Возможны две различные ситуации. Предположим, что первая генерация белоксинтезирующего аппарата, который продуцирует аминоацил-тРНК — синтетазу, рибосомные белки и т. д., не допускает ошибок. Так как точность работы аппарата не абсолютна, вторая генерация может допускать несколько ошибок, третья — еще больше и т. д. В ходе этого процесса может возникнуть одна из двух ситуаций: 1) частота ошибок рано или поздно достигнет такого высокого уровня, что клетки не смогут дальше функционировать, произойдет "катастрофа ошибок"; 2) частота ошибок может приблизиться к постоянному положительному значению или достичь равновесного уровня, при котором нельзя будет обнаружить феномен старения. Оргел [90] считает, что клетки могут создавать белоксинтезирующий аппарат, допускающий меньше число ошибок, из аппарата с более высоким уровнем ошибок; они делают это с помощью ферментов, которые убирают ошибочные белки [36], в результате чего происходит стабилизация малой частоты ошибки.

Ряд исследователей провели эксперименты с целью проверить теорию ошибок. Принц и Гросс [95] нашли, что мутант leu-5 Neurospora синтезирует термочувствительный лейцин-активирующий фермент, который при высокой температуре замещает Leu другими аминокислотами в период трансляции. При низкой температуре синтез белка протекает более или менее нормально и Neurospora имеет обычную продолжительность жизни. Однако при повышенной температуре (35 °C) мутант раньше подвергается старению. Левис и Холлидей [70] сообщили, что точность синтеза белка снижается, когда этот мутант содержится при 37 °C вместо 25. Впрочем, частота ошибок вскоре стабилизируется и остается постоянной значительное время. Однако клетки начинают стареть примерно после 70 ч. Авторы представили данные о том, что при 37 °C быстро снижаются термолабильность и удельная активность глутаматдегидрогеназы этого гриба.

Ошибки в синтезе белка могут также возникать вследствие соматических мутаций или наоборот. Поэтому эти два механизма трудно отличить один от другого. Например, ошибки в белоксинтезирующем аппарате могут привести к изменению структуры ДНК-полимер азы, которая в свою очередь может способствовать возникновению ошибок или мутаций в ДНК путем введения неправильных нуклеотидов при репликации [49].

Если накопление ошибок является причиной старения клеток, то необходимо ответить на ряд вопросов. Например, вопрос, который поставил сам Оргел [90], заключается в следующем: почему ошибки не накапливаются в клетках зародышевого пути? Если бы они там накапливались, то виды вымерли бы. Оргел предполагает, что процессы "контроля качества" могут действовать в период оогенеза и раннего развития и приводить к элиминации яйцеклеток или эмбрионов с высоким уровнем ошибок, как это происходит с яйцеклетками человека в пожилом возрасте. Другой вопрос состоит в том, как и почему такой механизм "контроля качества", если он существует, прекращает функционировать после завершения развития? Более того, если возникновение ошибок есть причина старения, прекращения деления клеток и их смерти, то отсюда следует, что трансформированные или опухолевые клетки не должны содержать ошибок. Маловероятно, чтобы репликация ДНК и синтез белка протекали в трансформированных клетках, с абсолютной точностью. Если при трансформации надежность увеличивается, то как это осуществляется?

Старение клеток in vitro рассматривали под другим углом зрения. Культивируемые клетки человека имеют ограниченный потенциал удвоения популяции, тем не менее иногда в культуре появляются клетки, которые делятся неопределенно долго. Кирквуд и Холлидей [68], Холлидей и др. [48] и Кирквуд [67] полагают, что клетки в культуре потенциально бессмертны, но в процессе роста культуры возникают определенные клетки, которые необратимо коммитированы к старению и смерти. Эти клетки какое-то время нормально размножаются, но после "инкубационного периода" М (который определяется числом делений между коммитированием и смертью) они стареют и погибают. Некоммитированные клетки продолжают делиться.

Предполагается, что клеточная популяция первоначально не коммитирована и может расти без ограничения, удваивая свой объем с каждым следующим делением до тех пор, пока при (М+1) — м делении не появятся погибшие клетки из числа первых коммитированных, которые уже достигли конца инкубационного периода. Тогда рост популяции замедляется и в дальнейшем зависит от значения фактора вероятности Р.

Если вероятность коммутирования и инкубационный период достаточно велики (Р>0,5), то число некоммитированных клеток в популяции прогрессивно снижается до 1 на 106 клеток, в итоге клетки погибают и выбывают из популяции. К этому времени все оставшиеся клетки коммитированы к старению, отчего популяция и становится смертной. Если вероятность коммитирований мала (Р<0,5) или продолжительность инкубационного периода невелика, то популяция может перейти в состояние устойчивого равновесия, при котором в ней будут находиться в постоянных соотношениях небольшая часть некоммитированных клеток, большое количество коммитированных и постоянная доля нежизнеспособных клеток. Размер клеточной популяции, таким образом, прямо связан с вероятностью потери последних некоммитированных клеток в культуре. Однако при обычной методике культивирования размер культуры ограничен и избыток клеток отбрасывается; если объем культуры не очень велик, то некоммитированные клетки теряются при "разведении". Обычно культуры содержат 106-107 клеток. Экспериментальные данные показывают, что если Р0,275, то М55-60. В зависимости от величин Р, М и числа клеток культуры либо растут непрерывно с постоянным уровнем коммитированных, некоммитированных и отживающих клеток, либо стареют и погибают. В связи с изложенным возникает ряд вопросов. Почему клетки становятся коммитированными и прекращают деление? Что влияет на этот процесс — геном или цитоплазм этические факторы? Иногда действительно в культуре находят фибробласты, которые делятся непрерывно, но они, как правило, отличаются от нормальных клеток необычным числом хромосом. Коммитирование клеток перед дифференцировкой происходит в раннем периоде развития, в результате чего некоторые клетки становятся неделящимися, т. е. постмитотическими. Это относится к нейронам, клеткам скелетной и сердечной мышц, которые синтезируют определенные белки и выполняют специфические функции. Вместе с тем некоторые клетки продолжают делиться на протяжении всей жизни, например клетки костного мозга и эпителия. Клетки того и другого типа, таким образом, являются коммитированными; как полагают, коммитирование возникает в результате дифференциальной экспрессии генов, что зависит от расположения клеток, а также от вне- и внутриклеточных факторов. Холлидей и др. [48] и Кирквуд [67] не объясняют, по какой причине клетки коммитируются к старению.

Кирквуд [67] предположил, что коммитирование соматических клеток в культуре может быть вызвано накоплением ошибок, так как этот процесс хуже регулируется вне организма. Он утверждает, что ошибки внутренне присущи всем процессам передачи макромолекулярной информации: "Для того, чтобы поддерживать дальнейшие эволюционные изменения и таким образом увеличивать возможность максимального выживания, любой организм должен совершать случайные ошибки кодирования". Создается впечатление, что организм знает, что он должен эволюционировать, и поэтому делает ошибки. Этот взгляд близок к идеям Вейсмана, которые были дискредитированы. Знает ли организм, где и когда делать ошибки, чтобы эволюционировать? Правда, если точность системы переноса информации была бы абсолютной, то, вероятно не было бы эволюции. Хоффман [47] сообщил, что механизм трансляции исключает ошибки, и, следовательно, "катастрофа ошибок" здесь невозможна. Кирквуд и Холлидей [68] указывают на нереальность такой точки зрения; они предполагают, что белоксинтезирующий аппарат может стабильно работать, даже: если он ошибается. Если обозначить общий уровень ошибок буквой R, то при малых значениях этой величины процесс накопления ошибок достигает стационарного состояния, а при больших R приводит к "катастрофе ошибок". Кирквуд и Холлидей считают, что эти явления лежат в основе эволюции. Мартин и др. [80] предположили, что in vivo клетки сохраняют способность к делению даже в старом возрасте. Средняя продолжительность жизни культуры (число удвоений популяции) составляет ∼ (42-0,2 X), где X — возраст донора. Следовательно, клетки даже 90-100-летнего индивидуума способны к 20–25 удвоениям популяции. Кирквуд [67] считает, что, как только клетки в культуре становятся коммитированными, размер популяции резко падает. Сходное положение может возникнуть in vivo, в результате чего орган теряет клетки, а следовательно, и активность. Это может быть обусловлено переходом белоксинтезирующего аппарата от стабильного состояния к нестабильному и появлением ошибок в белках.

По предположению Хопфилда [60] можно избежать ошибок репликации путем затраты дополнительной энергии на тщательное считывание информации или на разрушение дефектных макромолекул. "Ферменты-чистильщики" могут удалять ошибочные белки. Точность синтеза в клетках зародышевого пути, необходимая для сохранения наследственной информации, для соматических клеток не столь существенна. Если в соматических клетках будет поддерживаться большая точность синтеза, то затраты энергии будут слишком велики. Кирквуд [67] предположил, что старение может быть следствием выключения механизмов, ответственных за высокую точность работы аппарата трансляции до или во время дифференцировки соматических клеток; этим достигается экономия энергии. Таким образом, соматические клетки функционируют в нестабильном режиме, происходит постепенное нарастание числа ошибок, что приводит через некоторое время к старению и "катастрофе ошибок". Однако известно, что отмирают и эмбриональные клетки (гл. 1). Почему именно эти, а не другие клетки коммитируют к старению на такой ранней стадии, почему возникают ошибки и что регулирует их уровень? Приведенные доводы не объясняют различий между клетками разных типов, такими, как нейроны и мышечные клетки, которые полностью прекращают деление, или клетки печени, которые постоянно медленно пролиферируют, или эпителиальные и кроветворные клетки, которые интенсивно делятся в течение (Всей жизни. Кроме того, связь между старением клеток in vitro и старением всего организма сомнительна, было показано, что фибробласты цыплят и человека имеют ограниченную продолжительность жизни, в то же время фибробласты быка, кролика, хомяка, крысы и мыши обладают неограниченной способностью к делению, хотя если потенциал удвоения популяции имеет какое-нибудь отношение к продолжительности жизни, можно было ожидать, что у этих клеток он должен быть меньше.

Ряд экспериментальных данных противоречит возможности появления ошибок в белках в таких количествах, которые могли бы вызвать старение или "катастрофу ошибок". Канунго и Ганди [59] сравнивали малатдегидрогеназу печени молодых и старых крыс иммунологическими методами. Они не обнаружили возрастных различий в свойствах ферментов. Следовательно, ген малатдегидрогеназы не подвергается с возрастом никаким структурным изменениям. Кинетические, электрофоретические и иммунологические исследования ацетилхолинэстеразы головного мозга [84] и аланинаминотрансферазы печени [93] также показали отсутствие явных возрастных различий. В дальнейшем это заключение подтвердилось тем, что карты триптических гидролизатов актина и миозина скелетной мышцы молодых, взрослых и старых (8, 21 и 84 нед) крыс оказались одинаковыми [117]. Очевидно, первичная структура ферментов при старении не изменяется.

Позже в исследованиях альдолазы из печени мыши [32,33] и цитоплазматической пероксид-дисмутазы из печени головного мозга и сердца крыс и мышей [97, 99] было показано, что антигенность, Км, Ki, электрофоретическая подвижность в полиакриламидном геле и полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия одинаковы для молодых и старых животных. Более того, при изоэлектрофокусировании этих ферментов не ВЫЯВИЛИ никаких различий в их электрических зарядах [39]. Наблюдали только различия в таких свойствах, как удельная активность фермента (ед/мг белка), которая была понижена у старых особей, и чувствительность к температуре, которая была повышена. Эти сдвиги были отнесены к посттрансляционным химическим изменениям типа фосфорилирования, ацетилирования, дезаминирования, аденилирования, окисления SH-групп и т. д., которые не определяются при электрофорезе в полиакриламидном геле [30]. Такие измененные молекулы имеют пониженную удельную активность и с возрастом накапливаются.

Однако сообщалось о различиях в антигенных свойствах альдолазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы из эритроцитов молодых и старых людей [55, 82]. Частоты соматических мутаций, установленные по изменениям глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы [27] и хромосомным отклонениям [125], значительно выше у старых животных. Ягил [131] показал, что электрофоретическая подвижность, электроиммунодиффузия и чувствительность к температуре глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназы печени одинаковы у молодых и старых мышей.

Исследования Гершона и его коллег показали близость величин Км, Ki, молекулярной массы и электрофоретической подвижности изоцитрат-лиазы [31] и альдолазы [133] у молодых и старых особей свободноживущей нематоды Turbatrix aceti. Однако ферменты старых животных обладали пониженной антигенностью и удельной активностью. Ротстайн и сотрудники изучили ряд ферментов молодых и старых Turbatrix aceti: изоцитрат-лиазу (рис. 9.4) [100], енолазу [111–113], триозофосфатизомеразу и фосфоглицераткиназу [40, 41], и в каждом случае молекулярная масса, Км, термостабильность и электрофоретическая подвижность были сходными. Каталитическая активность, однако, была ниже в старом возрасте, что, как предположили авторы, может быть вызвано полной инактивацией молекул фермента, но не включением ошибочных аминокислот. Возрастные изменения изоцитрат-лиазы, енолазы и фосфоглицераткиназы были также исследованы в гомогенной популяции Turbatrix aceti; гомогенность культуры достигалась удалением вновь появляющихся особей через равные интервалы времени. В старом возрасте каталитическая активность всех исследованных ферментов снижалась. Кроме того, енолаза старых особей отличалась по антигенности от фермента молодых животных [113]. На основе этих данных Ротстайн [105, 106] предположил, что наблюдаемые различия вызваны конформационными изменениями, но не замещением аминокислот.

Рис. 9.4. Зависимость общей активности изоцитрат-лиазы, преципитированной данным количеством антител, от возраста круглого червя Tyrbatrix aceti [100]

Были сделаны попытки определить накопление ошибок в белках в зависимости от возраста культивируемых фибробластов. Холлидей и Террент [49] описали увеличение доли неактивной и термолабильной глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназы на поздних пассажах фибробластов MRC-5. Лактатдегидрогеназа фибробластов поздних пассажей этой линии отличалась по антигенности от фермента ранних пассажных клеток [71]. Голдстайн и Мёрмен [37] представили сходные данные по трем ферментам фибробластов кожи человека. Имеются данные не только о значительном уменьшении точности работы ДНК-полимеразы в клетках поздних пассажей (что изучалось с помощью синтетических матриц), но и об уменьшении скорости элонгации репликона [73]. Большой процент ошибок, регистрируемый этими авторами, вряд ли присущ нормальным клеткам; поскольку он был бы для них катастрофичным, не исключено, что регистрируемая неточность считывания обусловлена использованием в качестве матриц синтетических полинуклеотидов. Мартин и др. [79] не обнаружили различий в термочувствительности и антигенности ферментов клеток ранних и поздних пассажей в культуре WI-38. Следовательно, иммунные и каталитические свойства, а также положение при электрофокусировании фосфоглицераткиназы, пируваткиназы типа М2, глюкозофосфатизомеразы и глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназы не отличаются у фибробластов ранних и поздних пассажей. Не изменяется также скорость, а следовательно, и надежность репликации вирусов.

Ферменты β-N-ацетилглюкозаминидаза, α-глкжозидаза и α-N-ацетилгалактозаминидаза лизосом и NADH-дегидрогеназа митохондрий молодых и старых фибробластов WI-38 имеют сходную термолабильность [52]. РНК-полимераза, которая участвует в синтезе белка и, согласно Оргелу, является одним из основных виновников появления ошибок, была изучена Ивенсом [25]. Он не нашел различий в термолабильности и удельной активности ферментов, полученных из молодых и старых клеток.

Гервин и др. [29] измерили ошибки считывания poly (U) in vitro в неочищенных препаратах, полученных в различное время из E. coli, растущей в присутствии дигидрострептомицина, который, как известно, вызывает ошибки трансляции. Они наблюдали значительное увеличение ошибок считывания poly (U), но их уровень достигал стабильных значений в присутствии антибиотика в течение нескольких генераций. Исследования Эделмена и Гелланта [24] in vivo дали сходные результаты. Оценка ошибочной трансляции (включение цистеина в флагеллин) у E. coli в присутствии стрептомицина показала, что частота ошибки становится в 50 раз выше, чем в норме, и затем стабилизируется на одном уровне (рис. 9.5). Таким образом, даже если ошибки появляются в процессе трансляции, то, как и предполагали Гоел и Икес [35], достигается стабилизация ее точности. Поэтому маловероятно, чтобы первопричиной старения было возникновение ошибок в процессе переноса информации.

Рис. 9.5. Кинетика частоты ошибки в присутствии и в отсутствие стрептомицина [24]. Культура АС92 была выращена в отсутствие стрептомицина, и в ней была измерена частота фоновой ошибки. В момент, отмеченный стрелкой, добавляли 5 мкг/мл стрептомицина и измеряли частоту ошибки на протяжении более чем восьми последующих генераций. После двух генераций в присутствии стрептомицина из культуры отбирали аликвоту, отмывали минимальной средой без добавок для удаления стрептомицина и ресуспендировали в среде с добавками. Снова вычисляли частоту ошибки. Культуру метили 3Н-аланином (53 Ки/ммоль) и 35S-сульфатом (2 мКд/нмоль) и выделяли флагеллин, как описано ранее [24]. Сплошная линия и темные значки — частота ошибок в клетках, растущих в присутствии стрептомицина; штриховая линия и светлые значки — частота ошибок в клетках после удаления стрептомицина; светлые и темные кружки и треугольники обозначают данные, полученные в двух экспериментах. Длина горизонтальных линий на значках указывает на фракции той генерации, в пределах которой включалась метка

В заключение можно сказать, что существует очень много данных о снижении в пожилом возрасте на 30–70 % удельной активности альдолазы А и В [32, 33] и пероксид-дисмутазы у крыс [[98, 99], а также изоцитрат-лиазы [31, 100], фруктозобисфосфат-альдолазы [133], енолазы [111] и фосфоглицераткиназы [41] у Turbatrix aceti. Для нескольких ферментов установлены различия в термолабильности и антигенных свойствах. Вместе с тем удельная активность триозофосфатизомеразы Turbatrix aceti [40] и орнитиндекарбоксилазы печени крыс [86, 87] не изменяется.

При измерении других параметров перечисленных ферментов: Км, Ki, электрофоретической подвижности и молекулярной массы никаких существенных различий не обнаружено. Каковы же причины возрастных изменений свойств ферментов? Использование совершенной методики типа изоэлектрофокусирования, с помощью которой можно разделять белки, отличающиеся только суммарным электрическим зарядом, не выявило никаких отличий между пероксид-дисмутазами молодых и старых крыс [39, 98, 99]. Более того, когда провели двумерное картирование белков верхних шейных нервных узлов молодых и старых крыс, также не нашли никаких различий, причем в одном направлении белки разделялись в соответствии с их изоэлектрической точкой, а в другом — в соответствии с их молекулярной массой [129]. Триптические карты актина и миозина скелетной мышцы молодых и старых крыс оказались одинаковыми [117].

Таким образом, имеются убедительные данные, которые показывают, что с увеличением возраста ошибки типа замещения аминокислот в белках не возникают в сколько-нибудь существенном количестве ни in vivo, ни in vitro. Появление ошибок является случайным процессом, и если бы они возникали, то существовали бы белки с замещенными аминокислотами, однако такие белки не обнаружены. Кроме того, более или менее постоянную продолжительность жизни видов и постепенное ослабление функции с увеличением возраста нельзя объяснить теорией ошибок, так как для того, чтобы иметь отношение к упомянутым феноменам, ошибки должны возникать с определенной скоростью. Приходится предполагать, что частота ошибок регулируется генами или другими факторами, что противоречит основной идее теории ошибок. Следовательно, маловероятно, чтобы причиной старения было нарастание ошибок в функциональных макромолекулах с возрастом.

Что же тогда служит причиной снижения удельной активности и увеличения термолабильности ферментов, наблюдаемых я пожилом возрасте? Считают, что эти изменения могут появляться в результате незначительных посттрансляционных модификаций белков типа гликозилирования, метилирования и т. д., которые не меняют суммарного электрического заряда молекулы [30]. Это возможно в том случае, если увеличение с возрастом времени полужизни T½ ферментов обусловлено снижением скорости их деградации. В этом случае молекулы сохраняются дольше и в большей степени подвергаются действию трансфераз, трансаминаз и т. д. Величина T½ белков будет возрастать, если снижается активность протеаз. Следовательно, необходимо объяснить, почему в старческом возрасте снижается активность ферментов деградации типа протеаз. Таким образом, рассмотренные гипотезы (теория ошибок и посттрансляционных изменений) являются поверхностными, они не вскрывают основной причины старения.

Теория ограничения кодона

Эта теория основана на предположении, что надежность трансляции в клетках зависит от точности считывания триплетных кодонов в молекуле мРНК. [2, 120, 121]. За точное считывание кодонов ответственны в основном тРНК и аминоацил-тРНК — синтетазы. Для кодирования двадцати аминокислот используется 61 триплетный кодон, причем генетический код является вырожденным, т. е. несколько аминокислот кодируются двумя или большим числом кодонов, которым соответствуют две или более изоакцепторных тРНК. Способность к аминоацилированию у разных изоакцепторных тРНК различна. Поэтому количественные изменения в спектре изоакцепторных тРНК могут влиять на скорость считывания и трансляцию. Используются те триплетные кодоны, для которых имеются в наличии соответствующие аминоацил-тРНК. Известно, что молекулы тРНК подвергаются посттранскрипционным модификациям оснований типа метилирования цитозина. Колебания степени этих модификаций могут влиять на аминоацилирование, а следовательно, и точность считывания кодонов мРНК во время трансляции.

Аминоацил-тРНК — синтетазы также играют большую роль в трансляции, так как они распознают соответствующие тРНК и нагружают их специфическими аминокислотами. Они существуют в виде изоферментов. Изменения их специфичности могут привести к неточному аминоацилированию тРНК, неправильному считыванию кодонов и включению неподходящих аминокислот, т. е. синтезу ошибочных белков. Таким образом, точность трансляции является ключевым фактором для сохранения нормальной активности клеток и нормального функционирования организма. Согласно рассматриваемой теории, после достижения половой зрелости может происходить потеря точности трансляции вследствие изменения тРНК и аминоацил-тРНК — синтетаз, что и является причиной старения.

Изменения изоакцепторных тРНК и аминоацил-тРНК — синтетаз возникают как при развитии, так и при старении. Семядоля сои полностью стареет за 21 день. Она содержит 6 изоакцепторных тРНК для Leu и 3 — для Tyr. Доля двух из этих шести тРНКLeu увеличивается между вторым и пятнадцатым днями. Содержание одной из изоакцепторных тРНКTyr снижается в течение 15 дней, тогда как количество другой в этот период увеличивается. Одновременно изменяется активность лейцил-тРНК — синтетаз; через 21 день активность синтетазы по отношению к изоакцепторным тРНК 1–4 резко снижается, но скорость ацилирования изоакцепторных тРНК 5 и. 6 остается высокой.

Количественные изменения изоакцепторных тРНКArg и тРНКTyr происходят во время старения свободноживущей нематоды Turbatrix aceti [101]. Айлен и др. [53] наблюдали изменения тРНКTyr и тРНКLeu и соответствующих синтетаз в период развития насекомого Tenebrio molitor. Исследования Хосбаха и Кабли [51] показали, что тРНК, выделенные из 35-дневной Drosophila melanogaster, аминоацилируются хуже, чем тРНК, выделенные из, 5-дневных насекомых. Кроме того, аминоацилирующая активность некоторых синтетаз старых мух составляет только, 50 %. уровня, характерного для молодых особей. По крайней мере одна из изоакцепторных тРНК (для Arg, He, Leu и Lys) хрусталика глаза и мышцы быка в период развития приобретает. 2-3-кратное количественное преимущество [91]. Хроматографические профили тРНКSer и тРНКPhe, выделенных из головного мозга и почки эмбриона кролика, существенно отличаются от профилей соответствующих тРНК из тканей взрослых кроликов.

Печень плода крысы содержит 6 изоакцепторных тРНКTyr, тогда как печень взрослого животного — только при [132]. Мейз и др. [81] обнаружили, что паренхиматозные клетки печени старых крыс содержат быстродеградирующую фракцию тРНК, которая отсутствует у крыс среднего возраста. К тому же тРНК старых крыс аминоацилируется хуже, чем тРНК из тканей животных среднего возраста, что может быть обусловлено различиями в их посттранскрипционных модификациях, особенно при метилировании оснований. При старении изменяется содержание изоакцепторных TPHKLys HTPHKSer. Особое значение имеет увеличение содержания изоакцепторных TPHKLys четвертого типа у старых крыс.

Эндогенные факторы, например гормоны, изменяют профиль тРНК. Профили тРНКSer, тРНКArg и TPHKLys меняются в печени петуха после введения эстрогена [8, 11, 76]. Поскольку содержание гормонов, особенно стероидов, с возрастом меняется (гл. 5), параллельно могут происходить изменения в тРНК, что в свою очередь отражается на синтезе белка.

Существует много данных о том, что профили тРНК и аминоацил-тРНК — синтетаз подвергаются последовательным изменениям во время дифференцировки и развития. В соответствии с рассматриваемой теорией к старению могут приводить изменения в скорости синтеза или репрессии различных изоакцепторных тРНК и (или) аминоацил-тРНК — синтетаз, происходящие по окончании репродуктивного периода. Однако специфические тРНК транскрибируются со специфических генов так же, как и мРНК для специфических синтетаз. Изменение профилей изоакцепторных тРНК напоминает изменение состава изоферментов, наблюдающееся на протяжении всей жизни (гл. 3). Теория ограничения кодона не объясняет, какие факторы, ответственные за изменение экспрессии генов, способны изменить содержание тРНК и синтетаз, или какие факторы, ответственные за посттранскрипционные модификации тРНК, влияют на ее специфичность по отношению к синтетазам. Изменения функциональных молекул этих двух типов в течение жизни аналогичны изменениям изоферментов и, следовательно, также являются вторичными. Итак, данная теория так же, как и все предыдущие, не способна выявить причины старения.

Теория генной регуляции

Все эукариоты обладают двумя характерными особенностями: 1) их способность адаптироваться в естественных условиях постепенно снижается после достижения половой зрелости, 2) все представители вида имеют более или менее постоянную, продолжительность жизни (табл. 1.1). Более того, установлена корреляция между длительностью развития и долголетием. Старение нельзя рассматривать как изолированную и независимую фазу жизни; его следует оценивать в совокупности с периодом развития и репродуктивным периодом, так как эти два периода влияют не только на, продолжительность жизни, но и на скорость, длительность и характер процесса старения. В этой связи уместно разобраться в следующих вопросах.

1. Имеется ряд данных, указывающих на то, что раннее, развитие есть результат последовательной активации и репрессии специфических генов.

а) Если обработать личинку Chironomus экдизоном, гормоном линьки, то гены, локализованные в различных хромосомах их слюнных желез, последовательно активируются, что заметно по образованию пуффов [18].

б) Различные цепи гемоглобина, синтез которых контролируется разными генами, при внутриутробном развитии человека образуются последовательно [134]. Гемоглобин 1-2-месячного плода представляет собой молекулы α2ε2. Затем появляется гемоглобин α2γ2, основной гемоглобин плода (foetal, HbF). Гемоглобин взрослых HbA, α2β2, появляется сразу после рождения. Гены α-, ε-, λ- и β-цепей активируются последовательно один за другим, но ген α-цепи остается активным с первого месяца внутриутробного развития до конца жизни. Кроме того, когда активируется ген γ-цепи, ген ε-цепи репрессируется, а, репрессия гена γ-цепи совпадает с активацией гена β-цепи во, время рождения. Другой факт, на который следует указать, состоит в том, что эти гены остаются активными в течение разных промежутков времени: ε — в течение ~2 мес, γ — в течение ~8 мес и β — всю Жизнь начиная с рождения. Факторы, ответственные за последовательное включение этих генов, неизвестны. Предполагают, что важную роль в этом процессе; играет уровень кислорода, поступающего к плоду в матке.

в) В период раннего развития морского ежа Lutechinus гистон Н1 одного типа (H1m) вырабатывается на стадии. морулы. Затем на стадии гаструлы образуется гистон другого типа, Hlg [4, 107]. Набор белков в тканях личинки Drosophila melanogaster меняется по мере ее развития [5]. Это указывает на последовательное изменение активности соответствующих генов. Все ткани личинки имеют некоторые общие белки, но каждая немногими белками все же отличается от другой.

г) Изоферменты лактатдегидрогеназы не только тканеспецифичны, они изменяются также во время развития [77, 78]. Было обнаружено [62, 115], что доля лактатдегидрогеназы М4 в сердце, головном мозгу и скелетной мышце старых (96 нед) крыс значительно снижена. Поскольку две субъединицы лактатдегидрогеназы, Н и М, кодируются разными генами, полученные данные говорят о том, что в старом возрасте ген для субъединицы М почему-то репрессируется. Аланинаминотрансфераза представляет собой димер, состоящий из субъединиц двух типов, А и В. Исследования аланинаминотрансферазы печени крыс показали, что ген А активен в раннем периоде жизни. При старении крыс ген А репрессируется, а ген В активируется, так что в старческом возрасте (100 нед) димерный фермент образуют только субъединицы В [60, 93]. Для глюкозофосфатизомеразы и алкогольдегидрогеназы дрозофилы с возрастом также наблюдается постепенное изменение изоферментных спектров (гл. 3). Полученные результаты указывают на то, что последовательная активация и репрессия генов происходит не только в период развития, но и на протяжении всей жизни.

2. В ряде работ было показано, что возрастные изменения ферментов обратимы, с возрастом активность одних ферментов снижается, других — повышается. Некоторые ферменты не подвержены возрастным изменениям (гл. 3). Уровни определенных ферментов, которые снижаются в пожилом возрасте, можно повысить введением стероидных гормонов, например холин-ацетилтрансферазы и ацетилхолинэстеразы головного мозга [54], пируваткиназы ткани сердца [15], тирозинаминотрансферазы [97] и аланинаминотрансферазы печени [92] крыс. Лаг-фаза индукции некоторых ферментов гормонами с возрастом увеличивается [1]. Это отражает уменьшение числа рецепторов или их сродства к гормонам [61]. Вместе с тем изменения в хроматине могут привести к ослаблению его связывания с комплексом гормон — рецептор, следствием чего будет ухудшение ответа на гормоны. В общем, однако, содержание некоторых ферментов можно изменить введением стероидных гормонов in vivo. Поскольку действие этих гормонов опосредовано экспрессией генов, результаты этих работ показывают, что те изменения, которые связаны с перестройкой функции генома, являются обратимыми.

3. а) Для того чтобы выяснить, изменяется ли с возрастом первичная структура белков, были изучены некоторые ферменты у молодых и старых животных. Замещение любой аминокислоты в белке указывало бы на изменение кодона соответствующего гена или на появление ошибок во время транскрипции/трансляции. Кинетические и иммунологические исследования малатдегидрогеназы [59], аргиназы [96], ацетилхолинэстеразы [84] и цитоплазматической аланинаминотрансферазы [93], выполненные Канунго и сотр., показали, что первичная структура этих ферментов у старых крыс, по-видимому, такая же, как у молодых. Сривастава [117] провел триптическое картирование актина и миозина скелетных мышц молодых, взрослых и старых крыс и никаких различий не обнаружил.

б) Работы Гершона и его сотрудников [30, 98, 99, 133] и Ротстайна и его сотрудников [106, 111] показали, что величины Км, Ki, электрофоретическая подвижность и положение при изоэлектрофокусировании различных ферментов нематоды Turbatrix aceti и крыс с возрастом не меняются. Снижение удельной активности и увеличение термолабильности ферментов в старом возрасте, по-видимому, обусловлено незначительными посттрансляционными изменениями боковых групп аминокислот, но не замещениями аминокислот. Хотя определение первичной структуры белков молодых и старых животных является лучшим способом для выяснения, остаются ли последовательности аминокислот специфических белков одинаковыми в течение всей жизни, этот способ вызывает некоторые возражения. Поскольку очистка любого фермента включает этапы, на которых происходит разделение молекул белка по ряду свойств, может происходить элиминация любого измененного белка. Поэтому обычно выделяют только те белки, которые имеют одинаковую первичную структуру. Однако современный уровень знаний позволяет утверждать, что первичная структура белков и, следовательно, последовательность нуклеотидов в соответствующих генах с возрастом не меняются.

Почему же тогда изменяется с возрастом содержание ферментов, кодируемых специфическими генами? Эти изменения, ответственные за перестройку различных функций, отмечаются на протяжении всей жизни. Если структура генов не зависит от возраста, то содержание ферментов может изменяться в результате функционирования или экспрессии генов, трансляции или обмена ферментов. Транскрипция и период экспрессии генов — наиболее ранние стадии синтеза белка, нарушение которых может быть причиной изменения уровня ферментов. Гены образуют комплексы с белками двух видов, гистонами и негистоновыми хромосомными белками (НГБ), которые могут влиять на их экспрессию. Гистоны — это основные, неспецифические белки, обладающие общим репрессивным действием на функцию гена. Они подвержены различным модификациям типа фосфорилирования, ацетилирования, метилирования и ADPрибозилирования которые в разной степени влияют на их ассоциацию с ДНК. Кроме того, степень подобных модификаций снижается не только с возрастом, но и после транскрипции [64–66].

НГБ гетерогенны и участвуют в тонкой регуляции экспрессии генов. Они также подвергаются ковалентным изменениями которые модулируются эффекторами типа эстрадиола и кальция [64]. НГБ принимают участие в транскрипции (гл. 2).

Ковалентные изменения хромосомных белков и их модуляция эндогенными эффекторами могут быть главной причиной, изменения экспрессии гена; они индуцируются в различные периоды жизни, вызывая изменения уровней продуктов генов, в. том числе ферментов, и побочных продуктов, таких, как гормоны и метаболиты (гл. 2). Последовательные появления и исчезновения белков во время дифференцировки проста являются показателем подобных изменений экспрессии гена. Как предположили Каплан и Ордал [12], на самой ранней стадий развития экспрессируется большинство генов, а по завершении развития все большее число генов становится необратимо репрессированным, что приводит к появлению клеток различных типов. Полагают, что это происходит под действием внутри- и межклеточных модуляторов. Бенкс и Мехеффи [7] предположили, что за дифференцировку ответственна сходная цикличная репрессия генов. В обоих случаях уровни модуляторов являются критическими для репрессии некоторых генов в одних, но не в других клетках. Так образуются дифференцированные клетку.

Возникает вопрос, каким образом после прохождения стадии дифференцировки и по достижении организмом способности к воспроизведению изменяется функциональное состояние генома, что приводит к снижению репродуктивной активности и началу старения. В 1970 г. Канунго [56] предложил генно-регуляторную теорию и в 1975 г. он [57] разработал ее в виде модели, которая объясняет два характерных признака старения: а) снижение функциональной активности и б) фиксированную продолжительность жизни представителей одного вида.

Нарушение функций после достижения половой зрелости

В соответствии с моделью старение [57, 58] может развиваться в результате изменения экспрессии генов после достижения половой зрелости. Как видно из схемы (рис. 9.6), дифференцировка и рост сопровождаются последовательной активацией и репрессией определенных уникальных генов, функционирующих только в этих фазах. Основные и побочные продукты генов, ответственные за дифференцировку и рост, достигают критического содержания и стимулируют другие уникальные гены, продукты которых, например половые стероидные гормоны, обусловливают переход к репродуктивному периоду. Репродуктивная способность жизненно необходима для сохранения и эволюции вида. Некоторые генные продукты, образующиеся в репродуктивной фазе, в свою очередь подавляют функцию генов роста и дифференцировки, в связи с чем дальнейший рост организма прекращается у большинства животных после короткого периода размножения. Вопрос состоит в том, почему репродуктивный период не продолжается беспредельно.

Рис. 9.6. Модель старения с некоторыми изменениями по Канунго [57]. Верхняя часть — условное изображение различных периодов жизни: развития, репродуктивного периода и старения. Нижняя часть — схема последовательной активации и репрессии генов; для большей ясности Число активных генов на рисунке сведено к минимуму, а постоянно репрессированные гены вообще не показаны. Период развития и репродуктивный период зависят от уникальных генов А-F и G-L соответственно. Согласно этой модели, никаких специфических генов старения не существует. Развитие начинается в результате последовательной активации генов А-F, продукт гена. А включает ген В и т. д. Некоторые гены поздней фазы развития Е и F включают уникальные гены G и H, функционирующие в раннем репродуктивном периоде. Эти гены в свою очередь последовательно включают другие гены репродуктивного периода. Организм достигает половой зрелости, когда образуется необходимое количество генных продуктов. При непрерывном размножении может происходить потеря определенных факторов, необходимых для сохранения активности некоторых важных генов. Выключение этих генов может привести к нарушению определенных функций. При непрерывном размножении могут также накапливаться выше критического уровня другие продукты (факторы), в результате чего будут активироваться нежелательные гены М и N, продукты которых могут быть причиной аутоиммунных заболеваний. Таким образом, снижение физиологических функций, наблюдаемое после некоторого периода размножения, может зависеть от дестабилизации работы генов в репродуктивном периоде

Репродуктивная способность организма наиболее высока вскоре после достижения половой зрелости. Однако при репродукции определенные факторы могут утрачиваться и, будучи утраченными, уже не возмещаются. А между тем эти факторы могут быть исключительно важны для поддержания определенных генов в состоянии экспрессии или репрессии, тогда как другие факторы в процессе репродукции могут накапливаться, что не только влияет на экспрессию определенных генов, но может приводить к активации некоторых нежелательных генов, например генов вирусов, которые обычно остаются репрессированными. В результате всех этих событий может произойти дестабилизация тех уникальных генов, от функционирования которых зависит репродуктивная способность. Иными словами, в репродуктивном периоде нарушается гомеостатический контроль. Происходит постепенное снижение плодовитости, что отчетливо регистрируется вскоре после достижения половой зрелости.

В соответствии с этой моделью, если организм обладает механизмом, при помощи которого он способен возместить утрату факторов, вызываемую длительной репродукцией, или предотвратить накопление нежелательных факторов выше критического уровня, его репродуктивный период и продолжительность жизни будут длиннее. И действительно, данные по продолжительности жизни млекопитающих указывают на существование такого механизма, так как у них в процессе эволюции происходило постепенное увеличение продолжительности жизни, особенно репродуктивного периода [23]. Причиной этого явления могли быть мутации генов, ответственных за данный период, которые, вероятно, в процессе эволюции подверглись отбору. Уменьшение репродуктивной способности и других функциональных показателей организма является следствием незавершенности этого процесса. Однако ограниченность репродуктивного периода косвенно благоприятствует видам, так как быстрая смена поколений способствует эволюции. Таким образом, короткий репродуктивный период и ограниченная продолжительность жизни были благотворными для видообразования.

Здесь уместно привести последние данные о влиянии одного гормона на функцию другого. Ниссенсон и др. [85] обнаружили, что 17β-эстрадиол повышает уровень рецепторов окситоцина в матке кролика и, таким образом, усиливает ее сократимость в ответ на окситоцин. Вместе с тем прогестерон снижает уровень окситоциновых рецепторов, а также сократимость матки. В старом возрасте содержание одних стероидных гормонов снижается, а некоторых других — не меняется (гл. 5). Происходящие сдвиги могут быть следствием размножения. Дисбаланс содержания гормонов и других эффекторов, вызванный репродукцией, а также такими факторами, как температура, питание и стресс, может привести к дестабилизации экспрессии генов, необходимых для размножения.

Репродуктивный период уникален в том отношении, что в этом периоде вырабатывается несколько единственных в своем роде факторов, например гормоны. Присутствие какого-либо гормона, необходимого для экспрессии одного или немногих генов, в очень высокой концентрации может оказать обратное действие на экспрессию тех генов, которые зависят от других гормонов. Таким образом, незначительные изменения содержания гормонов и других метаболитов-эффекторов могут дестабилизировать гомеостатический контроль в репродуктивном периоде. Сходные результаты наблюдаются даже в. том случае, если животные по каким-либо причинам не способны к размножению. Обоюдное влияние одного гормона на другой может возникнуть после достижения их максимальных концентраций в период половой зрелости, что приведет к дестабилизации генов. Таким образом, изменения содержания гормонов и других модуляторов, прямо или косвенно влияющих на функцию генома, могут привести к постепенному снижению репродуктивной активности и к старению. Для изменений содержания модуляторов характерен не аддитивный, а скорее синергичный эффект, что может быть причиной экспоненциального снижения функциональных показателей организма при старении. Так, общая скорость нарушения функций у человека между 70 и 80 годами много выше, чем между 60 и 70 годами.

Определение продолжительности жизни

Продолжительность жизни видов можно приблизительно, разделить на три периода: развитие, репродуктивный период (размножение) и старение. Каждый период имеет характерную протяженность, скорость и регуляторные механизмы. Начало, скорость и продолжительность периодов развития и размножения зависят от уникальных наборов генов, которые последовательно активируются и репрессируются. Продолжительность этих периодов изменяется в определенных пределах и на нее влияют как эндогенные, так и экзогенные факторы: питание, стресс и температура. От этого зависит изменчивость продолжительности всей жизни и ее отдельных периодов у особей данного вида.

Вариабельность продолжительности периодов жизни, наблюдаемая, например, у млекопитающих, зависит от времени, требующегося для активации или репрессии необходимых генов. Количество ДНК и число генов, активирующихся в каждом периоде жизни, у различных видов млекопитающих могут различаться очень мало. Продолжительность жизни человека примерно в 50 раз превышает продолжительность жизни землеройки, но по количеству ДНК эти виды отличаются друг от друга незначительно. Время, необходимое для активации и репрессии генов, и содержание эффекторов, участвующих в этих процессах, могут детерминировать не только длительность, но и скорость прохождения каждого периода.

Новые виды, которые эволюционируют из предшествующих, могут обладать более коротким или более длинным по сравнению с последними сроком жизни. Это обусловлено генетическими изменениями: делецией, транслокацией, дупликацией, перестройкой и мутацией одного или нескольких генов в одном или нескольких периодах жизни. В результате меняется реактивность генов по отношению к эффекторам и укорачивается или удлиняется, один или несколько периодов жизни, т. е. изменяется, общая ее продолжительность. Например, если ген D (рис. 9.6) изменится так, что потребуется больше времени для его активации под влиянием продукта предыдущего гена, из-за чего побочный продукт последнего также будет производиться дополнительно, то будет наблюдаться удлинение фазы роста начиная с этого периода. Вместе с тем ген D может измениться таким образом, что содержание его продукта достигнет порогового уровня раньше и раньше активирует следующий ген последовательности. Такая перестройка приведет к сокращению данного периода и общей продолжительней жизни. Аналогичные изменения гена J в репродуктивном периоде могут удлинить этот период и следовательно, повлиять на продолжительность жизни. Такие изменения одного или нескольких генов в периоде репродукции у короткоживущих млекопитающих, которые быстро достигают половой зрелости, могли повлечь за собой постепенное удлинение этого периода и вызвать развитие долгоживущих млекопитающих. Если активация гена J ускорится, то за этим последует сокращение репродуктивного периода. Такие генетические изменения, которые способствуют созреванию организма в подходящее время, создают селективные преимущества. Генетические сдвиги, которые приводят к созреванию в неподходящее время, действуют против отбора. Первые будут способствовать лучшему выживанию и развитию особей, они будут отобраны и помогут сохранению вида. Такие изменения функции генов могли играть большую роль в процессе отбора, что существенно для эволюции.

Ускорение или замедление последовательных процессов активации и репрессии генов может начаться в любой точке данной последовательности функционирования генов для каждого периода и зависит от того, где именно происходит изменение одного или нескольких генов. Поэтому периоды жизни формируются каждый раз, когда возникают новые виды. Это может приводить к укорочению или удлинению жизни новых видов по сравнению с их предками и определять различия в продолжительности жизни родственных видов млекопитающих (табл. 1.1). Другие механизмы, которые изменяют продолжительность и скорость протекания каждого периода, могут быть связаны со временем, необходимым для процессинга гяРНК в мРНК в ядре и для трансляции мРНК.

Подтверждение модели

В соответствии с рассматриваемой моделью (рис. 9.6) изменения в генах, происходящие в определенное время данного периода, могут повлиять не только на длительность и скорость протекания данного периода, но и на общую продолжительность жизни. Основные положения этой модели подтверждаются симптомами наследственных болезней человека — прогерии и синдрома Вернера. Причиной прогерии является мутация аутосомного гена. В этом случае, даже если новорожденный ребенок кажется нормальным и нормально растет, примерно в 6-летнем возрасте у него обнаруживаются признаки старения, а в 8 лет появляются такие старческие симптомы, как атеросклероз, накопление липофусцина, поседение волос и пр., т. е. ребенок выглядит как преждевременно состарившийся человек. Кроме того, фибробласты, полученные от 9-летних больных прогерией, претерпевают меньшее число удвоений популяций, чем фибробласты здорового 9-летнего ребенка. Очевидно, такое состояние вызвано изменениями в одном или нескольких генах, необходимых, согласно модели, для развития организма. Мутация в этих генах, возможно, препятствует синтезу важного фактора (факторов), который необходим для дальнейшего развития и роста ребенка. Отсутствует инициация перехода в репродуктивный период, так как это событие зависит от включения нескольких уникальных генов, осуществляемого факторами, которые продуцируются в относительно поздней стадии развития, а эти факторы у больных прогерией не образуются. Следовательно, рост не завершается, сокращается период развития и полового созревания не происходит. С момента экспрессии мутантных генов продолжительность жизни сокращается. Не исключено, что продукты мутантных генов включают функционирование каких-то нежелательных генов. Было бы важно выяснить, продуцируются ли при этом половые гормоны и в каком количестве. Подобно прогерии, синдром Вернера также является наследственным заболеванием, которое вызывается мутацией аутосомного гена. У больных с синдромом Вернера развитие по длительности и характеру протекает более или менее нормально. По-видимому, мутации происходят в одном или нескольких генах, ответственных за инициацию и поддержание половой функции в репродуктивном периоде. В этом случае сокращается репродуктивный период, а следовательно, и продолжительность жизни. Исследование большого числа мутаций у человека и животных, которые изменяют длительность развития и репродуктивного периода, могло бы внести ясность в этот вопрос.

Другим подходящим примером является феномен "внезапной смерти", наблюдаемый у самки осьминога [130]. Самки осьминога Octopus hummelincki откладывают яйца только один раз; высиживая их, они отказываются от пищи и погибают вскоре после вылупления молодых особей. Если после кладки у животного удаляют обе глазные железы, оно не высиживает яйца, продолжает питаться и расти и долго живет. Очевидно, в глазной железе вырабатываются определенные факторы, ответственные за высиживание и прекращение приема пищи, из-за чего наступает старость и смерть. Удаление железы или этих факторов предохраняет животное от ранней гибели. По-видимому, в процессе кладки яиц может истощиться запас каких-то веществ, способных стимулировать зрительные железы к образованию гормонов, изменяющих поведение. Было бы важно установить, сохранит ли жизнеспособность и будет ли расти самка осьминога, если ее подвергнуть стерилизации. Сходное явление наблюдается у лосося и некоторых насекомых.

Резюме

Каждый вид имеет уникальный набор генов, необходимых для развития и размножения. Их последовательная активация/репрессия, начиная с оплодотворения, определяет продолжительность периода развития и начало репродуктивного периода. Продолжительность репродуктивного периода зависит от способности организма возмещать утраченные факторы и (или) предупреждать накопление некоторых других факторов. Утрачиваемые факторы могут быть необходимы для поддержания определенных генов в активном состоянии, а других — в репрессированном. Факторы, которые накапливаются, могут инициировать некоторые нежелательные гены, например гены вирусов, или воздействовать на функцию других важных генов. Результатом дисбаланса факторов и модуляторов является потеря организмом репродуктивной и других функций, т. е. старение. Последней рассмотренной теорией не предусматриваются никакие уникальные гены, которые вызывают старение. Не предполагается также, что старение запрограммировано как развитие и размножение. Тогда как периоды развития и размножения находятся под контролем уникальных генов, которые активируются или репрессируются в определенное время, в соответствии с данной моделью никакие специальные гены в процессе старения не участвуют. Следовательно, старение нельзя считать запрограммированным событием, иначе нужно допустить существование специфических генов, предназначенных для этой цели и отобранных в ходе эволюции, которые активируются в определенное время после репродуктивного периода. Предполагают, что физиологическое старение — только следствие полового созревания, причем оно реализуется и в том случае, когда размножение не осуществляется. Преждевременное старение, как видно на примерах прогерии и синдрома Вернера, является патологическим и вызывается мутациями. Оно возникает вследствие дестабилизации гомеостатического контроля генов, функционирующих в репродуктивном периоде. Отсюда следует возможность продления репродуктивного периода путем улучшения функции генома, например возмещением утраченных факторов или удалением накопившихся вредных продуктов, и действительно, у млекопитающих в ходе эволюции отмечено постепенное увеличение продолжительности жизни, в частности репродуктивного периода. Это указывает на то, что происходил отбор в пользу видов с большей продолжительностью жизни и более длинным репродуктивным периодом. Следовательно, предположение об эволюции старения так же невероятно, как предположение о программировании старения по аналогии с периодами развития и размножения. Несомненно, старение сыграло в эволюции положительную роль, так как оно способствовало избавлению популяции от неразмножающихся особей, что создавало условия для размножения более молодых; тем самым оно благоприятствовало обновлению вида. Благодаря этому появлялись особи с новыми свойствами, более перспективными для отбора и эволюции.

Литература

1. Adelman R. C. In: Enzyme Induction (D. V. Parke, Ed.), 303–311, Plenum Press, New York (1975).

2. Andron L. A., II, Strehler B. L. Mech. Age. Dev., 2, 97-116 (1973).

3. Atlan H., Miquel J., Binnard R. M. J. Gerontol., 24, 1–4 (1969).

4. Arceci R. J., Senger D. R., Gross P. R. Cell, 9, 171–178 (1976).

5. Arking R. Devi. Biol., 63, 118–127 (1978).

6. Asdell S. Patterns of Mammalian Reproduction, Comstock Publishing Co., Ithaca, New York (1946).

7. Banks H. R., Mahaffy J. M. J. Theo. Biol., 74, 323–324 (1978).

8. Bemfield M. B., Maetvpac P. H. Cancer Res., 31, 684–687 (1971).

9. Bick M. D., Liebke H., Cherry J. H., Strehler B. L. Biochim. Biophys. Acta, 204, 175–182 (1970).

10. Bick M. D., Strehler B. L. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 68, 224–228 (1971).

11. Busby W., Hele P. Biochim. Biophys. Acta, 224, 413–422 (1970).

12. Caplan A. I., Ordahl C. P. Science, 201, 120–130 (1978).

13. Casarett G. W. J. Gerontol., 11, 436–439 (1956).

14. Casarett G. W. Adv. Gerontol. Res., 1, 109–163 (1961).

15. Chainy G. B. N., Kanungo M. S. Biochim. Biophys. Acta, 540, 65–72: (1978).

16. Chetsanga C. J., Boyd V., Peterson L., Rushlow K. Nature, 253, 130–131 (1976).

17. Clark A., Rubin M. A. Radiat. Res., 15, 244–248 (1961).

18. Clever V., Romball C. G. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 56, 1470–1473 (1966).

19. Crowley C, Curtis H. J. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 49, 626–628 (1963).

20. Curtis H. J. Science, 141, 686–694 (1963).

21. Curtis H. J. Fed. Proc, 23, 662–667 (1964).

22. Curtis H. J. Biological Mechanisms of Aging, Thomas, Springfield (1966),

23. Cutler R. G. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 72, 4664–4668 (1975).

24. Edelmann P., Gallant J. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 74, 3396–3398 (1977).

25. Evans G. In: The Biology of Aging (B. L. Strehler, Ed.), 170–175, Am. Inst. Biol, Sci., Washington (1960).

26. Failla G. In "The Biology of Aging" (B. L. Strehler Ed.), 170–175. Am. Inst. Biol. Sci., Washington (1960).

27. Fulder S. J., Holliday R. Cell, 6, 67–75 (1975).

28. Gartner L. P. Gerontologia, 19, 295–302 (1973).

29. Garvin R. T., Rosset R., Gorini L. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 70, 2762–2766 (1973).

30. Gershon D. Mech. Age. Dev., 9, 189–196 (1979).

31. Gershon H., Gershon D. Nature, 227, 1214–1217 (1970).

32. Gershon H., Gershon D. Mech. Age. Dev., 2, 33–41 (1973).

33. Gershon H., Gershon D. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 70, 909–913 (1973).

34. Gershon D., Reznick A., Reiss U. In: Biochemistry of Aging (N. Kharasch, Ed.), Raven Press, New York (1978).

35. Goel N. S., Yeas M. J. Theo. Biol., 55, 246–282 (1975).

36. Goldberg A. L. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 69, 422–426 (1972).

37. Goldstein S., Moerman C. J. Nature, 255, 159 (1975).

38. Goldstein S., Moerman C. J. New Eng. J. Med, 292, 1306–1309 (1975).

39. Goren R., Reznick A. Z., Reiss U., Gershon D. FEBS Lett., 84, 83–86 (1977).

40. Gupta S. K., Rothstein M. Arch. Biochem. Biophys., 174, 333–338 (1976).

41. Gupta S. K., Rothstein M. Biochim. Biophys. Acta, 445, 632–644 (1976).

42. Handler P., Fed. Proc. (Suppl. 8), 20, 46–50 (1961).

43. Hart R. W., Setlow R. B. Proc. nat. Acad. Sci, USA, 71, 2169–2173 (1974).

44. Henshaw P. S. Radiology, 69, 30–36 (1957).

45. Hill B. T., Whelan R. D. H. Gerontology, 24, 326–336 (1978)

46. Hoehn H., Bryant E. M., Johnston P., Norwood T. H., Martin G. M. Nature, 258, 608–609 (1975).

47. Hoffman O. W. J. molec. Biol, 86, 349–362 (1974).

48. Holliday R., Huschtscha L. I., Tarrant G. M., Kirkwood T. B. L. Science, 198, 366–372 (1977).

49. Holliday R., Tarrant G. M. Nature, 238, 26–30 (1972).

50. Hoofield J. J. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 71, 4135–4139 (1974).

51. Hosbach H. A., Kubli E. Mech. Age. Dev, 10, 131–140 (1979).

52. Houben A., Remade J. Nature, 275, 59–60 (1978).

53. Ilan J., Han J., Patel N. J. biol. Chem, 245, 1275–1281 (1970).

54. James T. C., Kanungo M. S. Biochim. Biophys. Acta, 538, 205–211 (1978).

55. Kahn A., Boivin P., Vibert M., Cottrean D., Dreyfus J. C. Biochimie, 56, 1395–1407 (1974).

56. Kanungo M. S. Biochem. Rev. (India), 41, 13–23 (1970).

57. Kanungo M. S. J. Theo. Biol., 53, 253–261 (1975).

58. Kanungo M. S. Interdisc. Topics. Gerontol, 10, 100–107 (1976).

59. Kanungo M. S, Gandhi B. S. Proc. nat. Acad. Sci, USA, 69, 2035–2038 (1972).

60. Kanungo M. S., Patnaik S. K. In: Regulation of Growth and Differentiated Function in Eukaryote Cells (G. P. Talwar, Ed.), 479–490, Raven Press, New York (1975).

61. Kanungo M. S., Patnaik S. K., Koul O. Nature, 253, 366–367 (1975).

62. Kanungo M. S., Singh S. N. Biochem. Biophys. Res. Commun, 21, 454–459 (1965).

63. Kanungo M. S, Thakur M. K. Biochem. Biophys. Res. Commun, 79, 1031–1036 (1977).

64. Kanungo M. S., Thakur M. K. Biochem. Biophys. Res. Commun, 86, 14–19 (1979).

65. Kanungo M. S, Thakur M. K. J. Steroid Biochem, 11, 879–887 (1979).

66. Kanungo M. S., Thakur M. K. Biochem. Biophys. Res. Commun, 87, 266–271 (1979).

67. Kirkwood T. B. L. Nature, 270, 301–304 (1977).

68. Kirkwood T. B. L., Holliday R. J. Theo. Biol., 53, 481–496 (1975).

69. Lamb M. J., McDonald R. P. Expl. Gerontol., 8, 207–217 (1973).

70. Lewis C. M., Holliday R. Nature, 228, 877–880 (1970).

71. Lewis C. M., Tarrant G. M. Nature, 239, 316–318 (1972).

72. Lindop P. J., Rotblat J. Proc. Rov. Soc. (B) bond, 154, 332–368 (1961).

73. Linn S., Kairis M., Holliday R. Proc. nat. Acad. Sci, USA, 73, 2818–2822 (1976).

74. Little J. B. Gerontologia, 22, 28–55 (1976).

75. Macieira-Coelho A., Daitloff C., Malaise E. Gerontology, 23, 290–305 (1977).

76. Maenpac P. H., Bemfield M. B. Biochemistry, 8, 4926–4935 (1969).

77. Markert C. L., Moller F. Proc. nat. Acad. Sci, USA, 45, 753–763 (1959).

78. Markert C. L., Ursprung H. Devi. Biol, 5, 363–381 (1962).

79. Martin G. M., Ogburn C. E., Sprague C. A. 10th Internat. Cong. Gerontol, Vol. 1, p. 68 (1975).

80. Martin G. M., Sprague C., Epstein C. Lab. Invest, 23, 86–92 (1970).

81. Mays L. L., Lawrence A. E., Ho R. W., Ackley S. Fed. Proc, 38, 1984–1988 (1979).

82. Mennecier F., Dreyfus J. C. Biochim. Biophvs. Acta, 364, 329–336 (1974).

83. Miquel J., Bensch K. G., Philpott D. E., Atlan H. Mech. Age. Dev, 1, 71–97 (1972).

84. Moudgil V. K., Kanungo M. S. Biochim. Biophys. Acta, 329, 211–220 (1973).

85. Nissenson R., Flouret G., Hechter O. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 75, 2044–2048 (1978).

86. Obenrader M., Prouty W. F. J. biol. Chem., 252, 2860–2865 (1977).

87. Obenrader M., Prouty W. F. J. biol. Chem., 252, 2866–2872 (1977).

88. Orgel L. E. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 49, 517–521 (1963).

89. Orgel L. E. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 67, 1476–1480 (1970).

90. Orgel L. E. Nature, 243, 441–445 (1973).

91. Ortwerth B. J. Biochemistry, 10, 4190–4197 (1971).

92. Patnaik S. K, Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 845–850 (1974).

93. Patnaik S. K., Kanungo M. S. Ind. J. Biochem. Biophys., 13, 117–124 (1976).

94. Price G. B., Modak S. P., Makinodan T. Science, 171, 917–920 (1971).

95. Printz D. B., Gross S. R. Genetics, 55, 451–467 (1967).

96. Rao S. S., Kanungo M. S. Ind. J. Biochem. Biophys., 11, 208–212 (1974).

97. Ratha B. K., Kanungo M. S. Mech. Age. Dev., 6, 431–439 (1977).

98. Reiss U., Gershon D. Europ. J. Biochem., 63, 617–623 (1976).

99. Reiss U., Gershon D. Biochem. Res. Commun., 73, 255–262 (1976).

100. Reiss V., Rothstein M. J. biol. Chem., 250, 826–830 (1975).

101. Reitz M. S., Sanadi D. R. Expl. Gerontol., 7, 119–129 (1972).

102. Rockstein M. Ln: Theoretical Aspects of Aging (M. Rockstein, Ed.), 1-10, Academic Press, New York and London (1974).

103. Rockstein M., Chasky J. A., Sussmann M. L. In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), 3-34, Reinhold, New York (1977).

104. Ross S., Scott G. Brit. J. Radiol., 12, 440–444 (1939).

105. Rothstein M. Mech. Age. Dev., 6, 241–257 (1977).

106. Rothstein M. Mech. Age. Dev., 9, 197–202 (1979).

107. Ruderman J., Baglioni C., Gross P. Nature, 247, 36–38 (1974).

108. Sacher G. A. Radiology, 67, 250–257 (1956).

109. Samis H. V., Jr., Falzone J. A., Jr., Wulff V. J. Gerontology, 12, 79–88 (1966).

110. Seltsen R., Sartwell. Amer. J. Epidemiol., 81, 2-22 (1965).

111. Sharma H. K., Gupta S. K., Rothstein M. Arch. Biochem. Biophys., 174, 324–332 (1976).

112. Sharma H. K., Rothstein M. Biochemistry, 17, 2869–2876 (1978).

113. Sharma H. K., Rothstein M. Mech. Age. Dev., 8, 341–354 (1978).

114. Sinex F. M. In: Theoretical Aspects of Aging (M. Rothstein, Ed.), 23–31, Academic Press, New York (1974).

115. Singh S. N., Kanungo M. S. J. biol. Chem., 243, 4526–4529 (1968).

116. Spector W. E. (Ed.). In: Handbook of Biological Data, 182–184, W. B. Saunders Co., London (1956).

117. Srivastava S. K. Biochemical changes in rats during aging, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University, Varanasi, India (1977).

118. Stevenson K. G., Curtis H. J. Radiat. Res., 15, 774–784 (1961).

119. Strehler B. L. J. Gerontol., 19, 83–87 (1964).

120. Strehler B. L. Time, Cells and Aging, pp. 307–324, Academic Press, New York and London (1977). [Имеется перевод 1-го изд.: Стрелер Б. Время, клетки и старение. — М.: "Мир", 1964.]

121. Strehler B. L., Hirsch G., Gusseck D., Johnson R., Bick M. J. Theo. Biol., 33, 429–474 (1971).

122. Szilard L. Nature, 184, 958–960 (1959).

123. Szilard L. Proc. nat. Acad. Sci., USA, 45, 30–45 (1959).

124. Thakur M. K., Das R., Kanungo M. S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 81, 828–831 (1978).

125. Thompson K. V. A., Holliday R. Expl. Cell. Res., 96, 1–6 (1975).

126. Thompson K. V. A., Holliday R. Expl. Cell. Res., 112, 281–287 (1978).

127. Walburg H. E., Cosgrove G. E., Upton A. C. In: Radiation and Aging (P. J. Lindop and G A. Sacher, Eds.), 361–365, Taylor and Francis Ltd., London (1966).

128. Warren S. J. Amer. Med. Assoc, 162, 464–468 (1956)

129. Wilson D. L., Hall M. E., Stone G. C. Gerontology, 24, 426–433 (1978).

130. Wodinsky J. Science, 198, 948–951 (1977).

131. Yagil G. Expl. Gerontol., 11, 73–78 (1976).

132. Yang W. K. Cancer Res., 31, 639–643 (1971).

133. Zeelon P., Gershon H., Gershon D. Biochemistry, 12, 1743–1750 (1973).

134. Zuckerkandl E. Scient. Amer., 212, 110–118 (1965).

Примечания

1

В дальнейшем для удобства мы будем называть возраст, соответствующий периоду развития, молодым, или незрелым; возраст, соответствующий репродуктивному периоду, — средним, или зрелым, и возраст, соответствующий периоду старения, — старым, или старческим. — Прим перев.

(обратно)

Оглавление

Предисловие редактора перевода

Предисловие

Глава 1. Введение

Глава 2. Хроматин: структура и функции

Глава 3. Изменение ферментов в процессе старения

Глава 4. Изменения коллагена

Глава 5. Изменения в гормональной системе

Глава 6. Образование поперечных сшивок, свободные радикалы и старческий пигмент

Глава 7. Изменения иммунной системы

Глава 8. Старение клетки

Глава 9. Теории старения Fueled by Johannes Gensfleisch zur Laden zum Gutenberg